AnkG对小鼠精神行为和认知功能的影响及机制探讨

【摘要】背景：AnkG是由Ank3基因编码的锚蛋白,在脑中广泛分布,尤其是前额叶皮层、海马及丘脑等处高表达。AnkG在脑中蛋白亚型主要有位于轴突起始段(AIS)和郎飞结处的270/480KD和位于轴膜近端的190KD,它们对动作电位的产生、扩布和再生及维持轴突-树突极性有着重要作用,而且是神经发生的必要蛋白。目前关于AnkG敲除小鼠的模型主要有AnkG外显子1b敲除的小鼠模型和采用shRNA构建的海马齿状回AnkG沉默的小鼠模型,这两种模型小鼠脑中的AnkG表达量均是明显下降的,而且通过行为学的检测发现这两种小鼠均具有躁狂和抑郁行为,不过这两种模型小鼠模型均未进行认知相关的研究。最近全基因组关联性研究表明,AnkG是双向情感障碍、精神分裂症及阿尔茨海默病发生的高风险易感基因,而且有多个单核苷酸序列多态性与上述疾病发生相关。关于AnkG参与晚发性AD的发病,最近的研究表明AnkG和Ap在arcAp模型小鼠脑中的细胞外存在共定位。Ap是淀粉样前体蛋白(APP)经过p-分泌酶和γ-分泌酶相继剪切后产生的,当APP和PS1突变时都可以导致Ap的生成增加。动物实验表明,给予arcAp模型小鼠AnkG主动免疫治疗之后,细胞外的老年斑明显减少,可见AnkG可能通过调节Ap的病理改变从而参与AD的发生发展。AnkG在神经系统中具有重要的神经保护作用,且动物实验研究发现一种临床常用的情绪稳定剂丙戊酸钠(VPA)可上调AnkG的表达,其可通过影响特异基因启动子的甲基化或乙酰化作用来调节某些基因的表达从而达到治疗神经精神疾病的作用,在我们的实验中也发现AnkG缺失小鼠具有明显的焦虑、抑郁和认知功能障碍,在给予该类小鼠生理安全剂量的VPA后能使上述异常行为得到改善。这提示AnkG可能会成为治疗神经精神疾病的作用靶点。通过体外AnkG启动子介导荧光素酶报告基因活性的研究,探讨VPA对AnkG表达的调控机制,为精神性疾病的治疗提供了新的治疗路径。为了能更好的认知AnkG在神经精神疾病中的作用及潜在机制,我们将分别通过AnkG对小鼠精神行为和认知功能的影响及机制探讨、AnkG缺失对APP/PS1转基因阿尔茨海默病模型小鼠的影响和丙戊酸钠对AnkG基因表达上调的机制研究三方面来探讨。方法：采用基因捕获的方法构建了AnkG缺失的模型小鼠,通过旷场实验、高架十字迷宫、明暗实验、糖水偏嗜实验、强迫游泳实验、Morris水迷宫及避暗实验来鉴定该模型小鼠的行为学,并采用Westernblotting检测与行为改变相关的已知蛋白如GluR1、NMDAR1、GABRA1、GABA-BR1、GABA-BR2、PSD-95和BDNF。将AnkG缺失小鼠和APP/PS1双转基因的阿尔茨海默病模型小鼠杂交后获得目的小鼠APP/PS-AnkG+/模型小鼠,通过新物体识别、Morris水迷宫和避暗实验来分析APP/PS-AnkG+/-模型小鼠的学习记忆能力。体外实验,利用生物信息学方法,对人和小鼠的AnkG启动子序列进行比对分析,克隆小鼠AnkG启动子；将该片段克隆至荧光素酶报告基因质粒pGL3构建真核表达载体；采用脂质体Lipofectamine2000将重组质粒和空载体质粒分别与pRL-CMV共转染至N2a细胞和293T细胞后,同时给予0,0.5及1mMol/L的VPA处理12h后,采用化学发光仪检测荧光素酶报告基因的活性。结果：成功构建AnkG缺失小鼠。X-gal染色和IHC结果显示AnkG在脑中分布广泛,尤其是海马和皮层；与WT小鼠相比,AnkG+/-小鼠脑中的AnkG表达量明显下降。AnkG+/-小鼠和WT小鼠的身长、体重、脑重及脑重/体重系数等指标无明显差别。行为学结果表明AnkG缺失小鼠具有明显的焦虑和抑郁行为及认知功能障碍：与WT小鼠相比,AnkG+/-小鼠在Rotarod中的运动协调能力和耐力无明显改变；在旷场边缘区停留时间增加和中心区探究次数减少；在高架十字迷宫中入开臂总次数比例下降和开臂停留的时间比例减少；在明暗实验中入暗潜伏期缩短且在暗室停留时间增加等反应其具有明显的焦虑行为。与WT小鼠相比,AnkG+/-小鼠在旷场中的直立次数和理毛次数减少,而不动时间增加；在糖水偏嗜实验中其糖水偏嗜指数下降,这些均反应AnkG+/-小鼠具有明显的抑郁行为。与WT小鼠相比,AnkG+/-小鼠在Morris水迷宫中训练期时找到平台的潜伏期长,空间探索期时的平台区运动距离,穿越平台所在象限的次数及平台区停留的时间都减少；在避暗实验中,入暗潜伏期缩短,暗室停留时间及错误次数均增加,这些提示AnkG+/-小鼠存在学习记忆能力的下降。Westernblotting结果显示：与WT小鼠相比,AnkG+/-小鼠海马区与焦虑相关的蛋白：GABA-BR1和GABA-BR2表达下降；与抑郁相关的蛋白：GABRA1、GluRl和BDNF表达下降及与认知相关的蛋白：GluR1和PSD-95表达下降,而NMDAR1无明显改变。6mo和12mo的APP/PS1小鼠脑中的AnkG和Ap在细胞外存在明显的共定位。PCR结果显示含有APP、PS1及GEO目的条带者为APP/PS1-AnkG+/-模型小鼠；2mo、4mo及8mo的敲除AnkG的APP/PS1双转基因小鼠,与其它各组小鼠相比其体重、脑重及脑重/体重系数均没有差别；免疫组化结果显示,在敲除AnkG的APP/PS1双转基因小鼠中,其脑组织中皮层和海马CA1、齿状回DG区域神经元内AnkG表达均明显下降。2mo的APP/PS1-AnkG+/-模型小鼠在新物体识别实验中的识别指数下降,Morris水迷宫定位航行实验中找到平台的潜伏期增加,且空间探索实验中小鼠穿越平台所在象限的次数和停留时间均减少,避暗实验中进入暗室的错误次数、暗室停留时间和运动距离增加,而明室运动距离减少,而2mo的APP/PS1小鼠与WT小鼠相比各项检测指标均无差别；与WT小鼠相比,4mo和8mo时APP/PS1-AnkCG+/-模型小鼠和APP/PS1模型小鼠的学习记忆能力均有明显下降,而且与APP/PS1小鼠相比,4mo的APP/PS1-AnkG+/-模型小鼠的明室停留时间和运动路程明显减少,而暗室停留时间增加。以上结果提示APP/PS1-AnkG+/-模型小鼠存在明显的认知功能障碍,不仅出现的比APP/PS1小鼠早,且4mo的APP/PS1-AnkG+/”模型小鼠比APP/PS1小鼠更严重。体外实验表明：酶切和测序鉴定均显示AnkG启动子克隆及其表达载体构建成功；荧光素酶活性检测显示AnkG启动子在N2a和293T细胞中均有较高的转录活性；0.5mMol/LVPA处理N2a细胞和293T细胞12h后,荧光素酶活性都明显上调。结论：本研究表明AnkG缺失小鼠具有明显的焦虑和抑郁行为及认知功能障碍。其可能通过降低脑内GABA-BR1、GABA-BR2、GABRA1、GluR1、BDNF和PSD-95等蛋白,破坏递质的兴奋性/抑制性平衡及突触可塑性等,影响脑内神经回路,从而导致行为学的改变。与APP/PS1小鼠相比,AnkG缺失的APP/PS1小鼠在早期就出现明显的认知功能障碍,同时这种认知功能障碍随着月龄的增加而显著增加。AnkG对神经系统起着重要的作用,且其可被VPA通过AnkG启动子在转录水平上调。
【作者】刘翠；
【导师】秦川；
【作者基本信息】北京协和医学院，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】焦虑；抑郁；认知障碍；AnkG；阿尔茨海默病；丙戊酸钠；

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