轮状病毒NSP1抑制天然免疫机制及其对宿主蛋白调控的研究

【摘要】轮状病毒(Rotavirus,RV)是导致5岁以下婴幼儿急性腹泻的最主要病原,每年导致60万人死亡,严重危害人类健康,目前其致病机制尚不清楚。阐明RV的致病机制,尤其是其逃逸宿主免疫防御机理,将为新型抗RV策略及疫苗的研发提供依据。RV非结构蛋白1(NSP1)在RV拮抗宿主天然免疫应答中起重要作用,其功能尚不完全清楚。目前的研究表明,NSP1蛋白可以通过介导干扰素调控因子(IRF)家族蛋白的降解,以及通过抑制核转录因子(NF-κB)的活化来阻断干扰素(IFN)信号通路,从而拮抗宿主抗病毒应答。然而,有证据表明不同种属来源RVNSP1同源性较低,而且不同NSP1蛋白与天然免疫的作用方式可能存在差异,如猪RVOSU株NSP1蛋白的IRF结合结构域并不能介导IRF蛋白的降解。这提示不同来源NSP1可能通过多种途径拮抗宿主天然免疫。鉴此,本研究拟进一步探索NSP1与IFN信号通路相互作用的靶点,深入探讨NSP1拮抗宿主天然免疫机理,并通过差异蛋白质组学技术,分析NSP1的表达对宿主细胞蛋白的调控,以期深入了解NSP1的功能。一、NSP1拮抗宿主天然免疫机理研究首先我们观察到已知通过降解IRF抑制IFN应答的RV毒株的NSP1在缺失IRF结合功能结构域后,仍可以抑制IFN-β启动子活性,提示NSP1存在其它拮抗IFN作用靶点。免疫沉淀分析发现NSP1可以与维甲酸诱导基因I(RIG-I)结合,并降低RIG-I蛋白表达,而且人、猴、猪等不同种属来源的RVNSP1均可以下调RIG-I.在RV感染时,我们发现随着病毒复制增加,RIG-I也出现表达量的变化,感染后4hRIG-I表达增加,而从感染后12h开始RIG-I表达逐渐减少,提示RIG-I在RV感染中确实被抑制。NSP1拥有RING结构域,但是否具有泛素连接酶活性尚未被直接证实。我们证实NSP1为泛素E3连接酶,可以增强细胞泛素化及自身泛素化,并且泛素连接酶功能与N端RING结构域相关。但是NSP1对RIG-I的抑制作用可能不是通过泛素-蛋白酶体途径。生物信息学预测表明,RIG-I中拥有Caspase1的切割位点,RIG-I是否通过激活Caspasel切割RIG-I拮抗其作用尚需要进一步研究。作为模式识别受体,RIG-I在机体监测入侵RV并启动天然免疫应答中发挥了极其重要的作用,本研究首次发现了NSP1可以减少RIG-I蛋白表达,以拮抗宿主IFN应答,该研究结果揭示RIG-I为NSP1作用新靶点,进一步丰富了对于RV逃逸宿主天然免疫机制的认识。二、NSP1对宿主细胞蛋白质组的影响为了进一步阐明NSP1的作用机制,我们利用荧光差异凝胶电泳(DIGE)技术结合质谱鉴定研究了过表达NSP1蛋白对宿主细胞蛋白质组的影响。过表达NSP1后,初步鉴定到12个差异表达蛋白质,其中4个表达上调,8个表达下调。通过Westernblot分析,我们对表达下调差异蛋白质Prohibitin、ERP29进行了验证,结果与DIGE结果一致。GeneOntology分析显示差异表达蛋白涉及细胞骨架、信号转导、分子伴侣、转录调控等功能。随后我们研究了表达上调的波形蛋白(Vimentin)和NSP1相互作用。免疫荧光显示RV感染后,波形蛋白细胞定位发生重新排列,提示波形蛋白可能与病毒复制和装配有关。进而我们利用激光共聚焦方法观察了转染NSP1后波形蛋白细胞定位变化,结果显示,不表达NSP1蛋白的细胞中,波形蛋白成网状纤维分布,而表达NSP1的细胞中,波形蛋白形成聚集体,并与NSP1蛋白共定位,提示NSP1蛋白表达可能是导致RV感染后波形蛋白发生重新排列的原因之一,NSP1通过与细胞骨架相互作用参与病毒复制。这些结果为进一步了解NSP1功能提供研究方向。综上所述,本研究首次揭示了RV可拮抗RIG-I而抑制天然免疫,且可调控细胞波形蛋白的表达和定位,这些发现为深入研究RV拮抗天然免疫的机制和RV复制机制打下了基础。
【作者】秦岚；
【导师】洪涛；王健伟；
【作者基本信息】北京协和医学院，病原生物学，2010，博士
【关键词】轮状病毒；非结构蛋白1；维甲酸诱导基因I；天然免疫；波形蛋白；复制；

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