β肾上腺素能受体通路对多发性骨髓瘤细胞的体外作用研究

【摘要】背景和目的儿茶酚胺加速多种肿瘤体外扩增,相反,抑制肾上腺素能受体则抑制肿瘤细胞生长。这在一定程度上解释了应激过度和肿瘤发生、转移之间的相关性。儿茶酚胺是否影响多发性骨髓瘤目前尚无系统报道。本文主要研究肾上腺素受体信号系统对骨髓瘤细胞、骨髓瘤骨髓基质细胞(MM-MSC)的影响,并初步探讨阻断β肾上腺素能受体对骨髓瘤细胞增殖的作用及机理。材料和方法：体外培养人骨髓瘤细胞系U266、RPMI8226,反转录PCR测定瘤细胞儿茶酚胺关键酶(酪氨酸羟化酶TH、多巴胺羟化酶DβH)mRNA的表达。在以下三种条件下应用MTS方法分别测定骨髓瘤细胞系及对照组淋巴母细胞NCI-BL2009的增殖变化：(1)加入给予不同浓度的肾上腺素处理,(2)同时加入抗肿瘤作用的硼替佐米和肾上腺素,(3)分别加入α受体激动剂及阻断剂、β受体激动剂及阻断剂,判断肾上腺素对肿瘤细胞的作用是通过何种受体亚型实现。进一步研究影响细胞增殖的β受体亚型：应用反转录PCR鉴定两种细胞系表达β肾上腺素能受体亚型β1、β2、β3的mRNA水平,比较其表达量差异,并分别应用β1、β2受体激动剂刺激瘤细胞后MTS检测细胞增殖变化。进而对β肾上腺素受体通路影响肿瘤细胞增殖的机制进行初步探索：(1)肾上腺素及β受体激动剂刺激后应用ELISA方法检测骨髓瘤细胞分泌VEGF变化；(2)研究广谱β受体阻断剂普萘洛尔对肿瘤瘤细胞及对照组淋巴母细胞细胞增殖的影响。MTS法检测0-400umol/1普萘洛尔作用24、48后细胞增殖变化,台盼兰对活细胞染色计数的方法检测低浓度普萘洛尔(0-50umol/1)长期作用于骨髓瘤细胞后(16d)活细胞数的变化。采用DAPI染核、AnnexinV-PI双染法评估细胞凋亡,同时采用Caspase3/7、8、9-Glo-assay检测瘤细胞凋亡蛋白的表达,采用westernblot免疫印迹方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达。第三部分测定肾上腺素,β受体阻断剂普萘洛尔对原代骨髓瘤细胞和骨髓基质细胞(MM-MSC)的作用。取多发性骨髓瘤患者抗凝骨髓,CD138免疫磁珠分选纯化骨髓瘤细胞,同时分选MM-MSC。对原代骨髓瘤细胞及BMSC给予不同浓度的肾上腺素、普萘洛尔处理,应用二乙酸荧光素(FDA)染料染色检测原代细胞活力变化,应用MTS方法检测MM-MSC细胞增殖变化。结果：骨髓瘤细胞系RPMI8226表达合成儿茶酚胺的关键酶TH、DβHmRNA。肾上腺素(>5umol/1,24h)刺激骨髓瘤细胞株U266、RPMI8226增殖(P<0.05),且成剂量依赖效应,最大浓度50μmol/L作用后增殖比例达到415%±34%、408%±34%(p<0.05)。肾上腺素可以抵消体外硼替佐米的抑制骨髓瘤细胞作用。肾上腺素的促增殖效果涉及α、β受体激活。此两种细胞系表达β2、β3受体的mRNA受体。广谱β受体阻滞剂普萘洛尔可以有效抑制骨髓瘤细胞株U266.RPMI8226增殖(>50umol/1,24/48h),且成剂量时间依赖效应,48h最大浓度400uM时细胞增殖活力下降至29.2%±4.6%、18.3%±2.0%(p<0.05)。低浓度普萘洛尔(10umol/1-50umol/1)长期处理此两种骨髓瘤细胞系(16d)可以抑制其增殖,台盼兰染色活细胞比例分别下降29.4%±2.3%-95.2%±1.7%(U266细胞,10umol/1-50umol/1,p<0.05).84.4%±2.5%-93.0%±5.2%(RPMI8226细胞,20umol/1-50umol/1p<0.05).普萘洛尔(200umol/1)作用后RPMI8226骨髓瘤细胞出现核碎裂比例增高。普萘洛尔(50-200umol/1)可以诱导U266.RPMI8226.MM.1S三种骨髓瘤细胞株晚期凋亡(AnnexinV-PI双阳性)比例升高。普萘洛尔可以促进U266.RPMI8226Caspase3/7.8.9的表达增高,200umol/1作用U266细胞6hcaspase3/7.8.9发光强度分别增加26743±7113RLU.7978±1805RLU.27705±2335RLU(p<0.05);作用RPMI8226细胞6hcaspase3/7、8、9发光强度分别增加21751±3760RLU.12070±1317RLU.53627±6882RLU(p<0.05).Westernblot检测显示50-100umol/1普萘洛尔可以促进U266细胞促凋亡蛋白Bax表达升高,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下调。肾上腺素及β受体激动剂并不促进肿瘤细胞VEGF的分泌增加。肾上腺素(100umol/1)可以促进MM-MSC的增殖,细胞增值活力变化为：235%±85.5%(p<0.05),普萘洛尔(200umol／1)可以抑制MM-MSC增殖活力,细胞增值活力变化为：76.3%±11.2%(p<0.05)。普萘洛尔可以抑制原代CD138+细胞细胞活力,FDA阳性率下降幅度为71.4%±30.5%(p<0.05)。结论：骨髓瘤细胞具有合成儿茶酚胺的关键酶,可能自合成、分泌儿茶酚胺类物质。肾上腺素能受体激活体外促进骨髓瘤细胞及BMSC的增殖,长期应激状态可能促进骨髓瘤细胞生长,对硼替佐米治疗反应不利。肾上腺素受体a、β均参与促进骨髓瘤细胞作用,β受体亚型中β2、β3mRNA表达强度高于β1,广谱β受体阻滞剂普萘洛尔体外可诱导骨髓瘤细胞凋亡,是一种潜在的抗骨髓瘤药物。
【作者】刘扬；
【导师】赵永强；庄俊玲；
【作者基本信息】北京协和医学院，临床医学，2014，博士
【关键词】多发性骨髓瘤；β肾上腺素能受体；普萘洛尔；细胞凋亡；

【参考文献】
[1]赵坚.我国社保基金运转状况及其保值增值问题探讨[D].苏州大学,金融学,2003,硕士.
[2]陈振,孙彦广.利用科里奥利力的直管式质量流量计[J].冶金自动化,1993,06:24-26+6-55.
[3]薛定宇.控制系统最优降阶技术与应用[J].控制与决策,1994,06:420-425.
[4]陈飞.晶态纳米碳基复合体的形貌控制及在电极材料中的应用[D].黑龙江大学,2011.
[5]王洋.C型臂系统精度分析及标定方法研究[D].中国科学院研究生院（长春光学精密机械与物理研究所）,机械工程,2012,硕士.
[6]付明明.顶板垮落对回风巷侧采空区三带内瓦斯运移和爆炸影响的试验研究[D].河北工程大学,采矿工程,2012,硕士.
[7]曾明,胥布工.一种用于事件监测的传感器网络拓扑控制策略[J].控制与决策,2009,12:1781-1785.
[8]徐付超.Ag改性TiNi合金的组织结构与性能[D].哈尔滨工业大学,材料物理与化学,2013,硕士.
[9]易树鸿,樊林波,唐晔.基于Rough集理论的知识之间影响程度的一种度量[J].遵义师范学院学报,2003,03:62-64.
[10]陈杰.湖南省财税支农对农民收入的影响研究[D].中南林业科技大学,农村与区域发展,2013,硕士.
[11]秦喜安.苏制200MW机组协调控制系统的设计与实现[D].华北电力大学（河北）,控制工程,2004,硕士.
[12]李芸彤.用于电化学电容器的功能化多壁碳纳米管的制备及其性能研究[D].华东理工大学,2012.
[13]谭爱平.基于WSN的能量有效MAC协议研究[D].湖南大学,计算机技术,2012,硕士.
[14]石秀丹.符号学视角下平面媒体房地产广告研究[D].东北师范大学,传播学,2012,硕士.
[15]桃尔.人的全面发展视角下的蒙古族大学生就业问题与对策探究[D].内蒙古农业大学,思想政治教育,2012,硕士.
[16]王静.沁水盆地煤层气产出水灌溉对土壤和作物影响研究[D].中国矿业大学,环境科学,2014,硕士.
[17]郭家稳.故障电弧模式识别方法的研究[D].沈阳工业大学,电机与电器,2013,硕士.
[18]王立岩.过程能力分析研究及其在电子和冷轧辊产品生产中的应用[D].东北大学　,2010.
[19]康学萍,江洪.独立学院图书馆发展现状研究——基于63所图书馆网站的调查[J].图书馆学研究,2014,03:15-19.
[20]黄艳新.计算机味觉信号识别的研究[D].吉林大学,2004.
[21]陈超.涉外定牌加工所涉侵犯商标权问题研究[D].华东政法大学,知识产权法,2012,硕士.
[22]张东钰.德尔福派克中国公司组织结构优化方案设计[D].吉林大学,工商管理,2004,硕士.
[23]赵庆杰.头针结合天智颗粒治疗中风后痴呆的临床疗效观察[D].黑龙江中医药大学,针灸推拿学（专业学位）,2013,硕士.
[24]李洪刚.AgO/CNTs/TiO_2纤维复合催化杀菌剂的制备与性能[D].中北大学,无机化学,2013,硕士.
[25]范月霞.我国夫妻约定财产制研究[D].东北师范大学,民商法学,2012,硕士.
[26]范涛.302不锈钢管件三辊冷轧工艺研究[D].沈阳理工大学,材料加工工程,2012,硕士.
[27]程世东.片段弓技术用于上颌双侧尖牙唇侧易位阻生的治疗[D].大连医科大学,口腔临床医学,2012,硕士.
[28]梁梅莉.纳米复合结构光电特性的优化设计与实验研究[D].哈尔滨工业大学,光学,2014,硕士.
[29]郑文婕.法律体系、产权保护与经济增长[D].厦门大学,管理经济学,2014,硕士.
[30]桑丽萍.石油企业成本控制系统研究[D].西南石油学院,2004.
[31]李欣欣.拮抗放线菌E001菌株对蔬菜灰霉病的生物防治[D].扬州大学,农药学,2011,硕士.
[32]胡应学.缺氧预处理对猪缺氧复氧冠状动脉内皮舒张功能的影响[D].广西医科大学,心胸外科（专业学位）,2013,硕士.
[33]马占菊.拓展训练对大学生社会适应能力影响的研究[D].河北师范大学,体育教育训练学,2012,硕士.
[34]李芳,游小杰,李艳.过调节现象对顺序开关分流调节器的影响[J].太阳能学报,2014,11:2119-2126.
[35]陈玲,赵静,薛澜.择优还是折衷?——转型期中国政策过程的一个解释框架和共识决策模型[J].管理世界,2010,08:59-72+187.
[36]乌兰.基于“非常规”物理实验的合作学习实践研究[D].内蒙古师范大学,学科教学（专业学位）,2012,硕士.
[37]王杰,田沛,陈陈.连续多项式混沌系统的全局控制[J].控制与决策,2000,03:309-313.
[38]彭利群.论我国外贸出口结构和产业结构的调整[D].湘潭大学,政治经济学,2001,硕士.
[39]徐统震.木犀草素抑制肺癌细胞A549的增殖及其联合化疗作用[D].山东大学,外科学,2013,硕士.
[40]侯云.合肥市当代建筑地域性研究[D].安徽建筑工业学院,城市规划与设计,2012,硕士.
[41]华逢春.国产化淀粉样蛋白显像剂[~（11）C]6-OH-BTA-1结合~（18）F-FDGPET在阿尔茨海默病中的应用研究[D].复旦大学,2011.
[42]常健.基于Web的继电保护管理信息系统的设计与研究[D].华北电力大学（河北）,电气工程,2004,硕士.
[43]任玉洁.顺义空港城现代服务业发展对策研究[D].北京交通大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[44]袁二军.青海南祁连盆地木里地区三叠系尕勒得寺组烃源岩特征及评价[D].中国地质大学（北京）,地质工程,2014,硕士.
[45]孔晶晶.论我国国际商事仲裁裁决撤销制度的完善[D].首都经济贸易大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[46]冯小勇.脊柱胸腰段屈曲压缩型骨折三种治疗方式的影像学评价[D].青岛大学,骨外科学,2013,硕士.
[47]何惠文.江门市新型农村社会养老保险政策问题研究[D].华南理工大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[48]王涛.一方水土两方人[D].中南民族大学,文艺学,2013,硕士.
[49]景鹏.子洲西川话语音研究[D].西北师范大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[50]贺小桁.关于X国企重组后人力资源整合问题的研究[D].首都经济贸易大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.