腺苷1型受体在高血压肾小管周毛细血管损伤中作用机制初探

【摘要】研究背景：高血压肾损害是终末期肾病的重要原因,其中恶性高血压肾损害更重、进展更快,肾脏1年生存率仅42%-57%。肾小管周毛细血管(Peritubularcapillary,PTC)是由肾小球出球动脉分出的肾小管周围的毛细血管网,直接决定小管间质的血流,在多种慢性肾脏病中PTC损伤与肾功能损害、肾小管间质病变密切相关。我们前期在原发恶性高血压患者中观察到肾小管周毛细血管PTC严重缺失,与肾功能损伤及肾小管间质病变程度相关性较好,是预测肾脏不良预后的独立危险因素,同时还伴有肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin-angiotensin-aldosteronesystem,RAAS)的高度活化。但在高血压良性肾硬化、慢性肾炎(如IgA肾病)继发的恶性高血压中是否存在类似的现象?尚不得而知。PTC血流由调节入球和出球动脉收缩、舒张的血管活性物质直接决定,其中收缩出球动脉的RAAS和收缩入球动脉的腺苷及其1型受体(A1adenosinereceptor,A1AR)的活化构成了致密斑区域管球反馈的精细平衡。但在高血压的PTC损伤中,RAAS活化、腺苷及A1AR激活的作用孰轻孰重并不清楚。另一方面,文献中间质的炎症反应(如巨噬细胞浸润)可能导致PTC血管生成促进因子和抑制因子的失衡,而在肾脏广泛分布的A1AR,在肾缺血再灌注动物模型中具有抑制肾脏局部炎症细胞募集的作用,但目前还没有A1AR在高血压微血管损伤中抗炎症作用的研究。因此探讨A1AR是否参与高血压肾损伤尤其是PTC损伤的调节,其具体机制是经典的血流动力学调节作用,还是新的抗炎机制有积极的意义。研究目的：1.观察高血压(良性肾硬化、原发和IgA肾病伴恶性高血压)患者肾脏PTC损伤、巨噬细胞浸润和肾素活化的特点,分析它们与临床病理的相关性；2.建立高盐皮质激素-低肾素-盐敏感高血压(DOCA-salt)小鼠动物模型,观察PTC缺失与蛋白尿、肾小管功能之间的关系,分析腺苷及其受体活化、RAAS水平、肾间质巨噬细胞浸润对PTC损伤的意义；3.在腺苷1型受体基因缺失(A1AR-/-)小鼠中建立DOCA-salt高血压模型,观察A1AR对高血压时肾间质巨噬细胞浸润和PTC损伤的保护作用。研究方法及结果：1.高血压患者PTC损伤与局部肾素表达、巨噬细胞浸润无关纳入2003年1月~2012年3月在北京协和医院临床病理资料完整的103例高血压肾损害患者,其中高血压良性肾硬化17例、IgA肾病伴恶性高血压34例、原发恶性高血压52例,对照为同期经肾活检证实肾脏病理结构接近正常的肾小球轻微病变19例。收集其临床病理资料,对肾脏病理改变进行半定量评分,行CD34(血管内皮特异性标记)、CD68(巨噬细胞标记)和肾素免疫组化染色,观察到：1)高血压患者均存在不同程度的PTC缺失,其程度与肾功能损伤、肾小管萎缩和间质纤维化显著相关；2)高血压患者均存在肾间质巨噬细胞浸润,并与肾功能损伤、蛋白尿程度、肾小管萎缩和间质纤维化显著相关,但与PTC相关性欠佳；3)高血压良性肾硬化患者肾脏球旁器肾素表达与肾小球轻微病变组无差异,但恶性高血压患者肾素显著增加,肾素表达水平与肾功能、肾脏病理改变和PTC损伤均无关；4)与高血压良性肾硬化患者相比,恶性高血压患者肾功能损害、PTC缺失及肾间质巨噬细胞浸润均更重。2.低肾素-盐敏感高血压小鼠PTC损伤与巨噬细胞浸润的关系2.1建立高盐皮质激素-低肾素-盐敏感高血压(DOCA-salt)小鼠模型麻醉下手术切除左肾,同时腹腔植入醋酸脱氧皮质酮(DOCA)缓释药片(200mg,60天缓释),联合高盐饮食(8%NaCl饲料+含0.9%NaCl±0.2%KCl饮用水)喂养,建立盐敏感高血压(DOCA-salt)小鼠模型。第0、1、2、4、8w监测血压心率,第0、4、8w收集24h尿标本测尿渗透压、白蛋白及电解质水平。观察到：DOCA-salt小鼠收缩压第1w即显著升高([122.3±9.5]mmHgvs.[113.5±4.7]mmHg,P<0.05),并进行性升高至第8w,显著高于同龄对照组([141.5±10.4]mmHgvs.[104.3±12.5]mmHg,P<0.05),同时伴心率明显减慢。与对照组相比,DOCA-salt小鼠第4、8w尿量分别增加2倍和4倍,尿渗透压降低约50%,给予血管加压素后尿渗透压能恢复正常；试验组小鼠尿钠排出量也显著增加(5~9倍),尿白蛋白／肌酐比增加数十倍。2.2DOCA-salt小鼠RAAS水平、肾间质巨噬细胞浸润与PTC损伤的关系建立DOCA-salt盐敏感高血压模型后第0、4、8w采集血浆,放免法测定肾素活性(PRA)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和醛固酮(ALD)水平,第4、8w处死时肾脏标本行免疫组化染色观察PTC缺失(CD34)和肾间质巨噬细胞(CD68)浸润情况,Realtime-PCR方法评价腺苷合成酶CD39±CD73和A1ARmRNA表达水平。观察到DOCA-salt小鼠：1)肾脏重量指数增加,肾脏病理第4w无明显改变,第8w肾小球周围出现肾小管萎缩和间质纤维化；2)PTC面积显著低于同龄对照小鼠(4w:[2.62±0.34]%vs.[4.57±0.79]%,P=0.004;8w:[2.57±0.20]%vs.[3.41±0.48]%,P=0.018),并与白蛋白尿(4w)、尿量增加(8w)相关(P<0.05)；单肾切除对照小鼠第8wPTC面积较第4w也有所减少；3)肾间质巨噬细胞浸润随周龄增加而加重,均高于同龄对照组小鼠(4w:[7.28±3.46]个/mm2vs.[0.46±0.29]个/mm2,P=0.008;8w:[24.87±12.13]个/mm2vs.[0.54±0.74]个/mm2.P=0.028),但与PTC损伤无关；4)PRA水平进行性减低,低于同龄对照组小鼠,减低程度与尿量增加相关(r=0.983,P=0.017),但与PTC面积无关；AngⅡ和ALD水平无显著改变；5)第4、8w肾脏腺苷合成酶CD73±CD39mRNA表达水平分别是对照组的2.22倍(P=-0.034)和5.36倍(P=-0.005),与蛋白尿、血压和尿量有不同程度的相关性；A1ARmRNA表达水平是对照的2.54倍(P=-0.032)。3.腺苷1型受体在高血压PTC损伤中的作用引进腺苷1型受体(A1AR)基因敲除杂合小鼠进行配种、繁殖和基因鉴定。在A1AR-／-小鼠中复制DOCA-salt盐敏感高血压模型,第4w处死,标本留取及观察评价方法同第二部分。A1AR-/-小鼠单肾切除后收缩压高于野生型对照小鼠,而建立DOCA-salt模型后无进一步升高。与野生型DOCA-salt小鼠相比,A1AR-/-DOCA-salt小鼠尿量更多([7003±3742]μlvs.[3606±2359]μl,P=0.031),肾小管间质损害出现更早(第4w),PTC面积更少([2.134-0.17]%vs.[2.62±±0.34]%,P=0.042),而血浆。肾素水平和肾间质巨噬细胞浸润与野生型DOCA-salt小鼠无差异。研究小结和结论：在本研究条件下观察到1.高血压患者均有不同程度的PTC缺失和肾间质巨噬细胞浸润,二者均与肾小管间质病理改变有良好的相关性；高血压良性肾硬化患者肾脏球旁器肾素表达与肾小球轻微病变组无差异,和肾功能及肾小管间质病理改变无关；PTC缺失与巨噬细胞浸润、肾素高表达无关；2.高盐皮质激素-低肾素-盐敏感高血压小鼠,第1周血压升高,随后出现明显的PTC缺失,伴有白蛋白尿和尿液浓缩功能障碍,同时腺苷合成酶CD73mRNA表达水平增加,随后(建模第8w)才出现明显的肾间质巨噬细胞浸润和间质纤维化；3.A1AR-/-小鼠建立盐敏感高血压模型后,与野生型DOCA-salt小鼠相比,血压并不进一步增加,但PTC损伤更重,肾小管间质病理改变出现更早,而肾间质巨噬细胞浸润无加重。由此可见,高血压的PTC损伤普遍存在,并与白蛋白尿、小管间质损伤密切相关,其机制可能与醛固酮的直接作用和肾小球的高灌注、高压力有关,其中腺苷及A1AR通过管球反馈起到保护作用,与间质巨噬细胞浸润和高肾素无关。
【作者】施潇潇；
【导师】陈丽萌；
【作者基本信息】北京协和医学院，临床医学，2014，博士
【关键词】高血压；肾小管周毛细血管；醛固酮；巨噬细胞；腺苷受体；

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