连作苹果园土壤酚酸类物质的分布及其对真菌的影响

【摘要】本研究于2011年3月-2014年3月在山东农业大学园艺科学与工程学院果树根系实验室、国家苹果工程实验中心以及作物生物学国家重点实验室进行。田间试验分别在山东省泰安市宁阳县磁窑镇、岱岳区道朗镇和烟台莱州市金城镇新建一片连作园；连续两年按原树穴、原行间和原株间三个取样位置并且分0-30cm和30-60cm在春、夏和秋季采集土样,利用ASE-HPLC法测定连作苹果园土壤中酚酸物质的种类、含量及年动态变化；砂培盆栽条件下,研究了土壤实测浓度的五种酚酸及其混合物对平邑甜茶幼苗生物量、根系线粒体相关指标、叶片抗氧化酶活性、TCA循环酶等指标的影响；同时,在盆栽连作条件下,研究了土壤实测浓度的五种酚酸及其混合物对土壤真菌多样性、均匀度、丰富度等指数的影响,以及对串珠和尖孢镰孢菌的影响。结果如下：1.首先研究建立了以ASE-HPLC为基础的快速、高效测定果园土壤酚酸类物质含量的新方法。以苹果特征酚酸类物质根皮苷为例,采用加速溶剂提取法(acceleratedsolventextraction,ASE)和高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)相结合的测定方法,对萃取溶剂、萃取温度、压力和循环数等参数进行优化,寻找ASE法提取酚酸类物质的最佳工艺条件。ASE法提取苹果园土壤酚酸类物质的最佳工艺条件为：先以无水乙醇为萃取溶剂,再以甲醇为萃取溶剂,提取温度为120℃,压强为10.300Mpa,循环2次,每次静态提取时间为5min,吹扫体积为60%,吹扫时间为90s。该方法样品处理简单,具有良好的重现性和线性,相关性系数均达到0.990,回收率在83%-98%之间,检测限为1.300×104-2.500×10-2μg/mL。ASE-HPLC法是一种简便、快速和高效测定土壤酚酸含量的新方法,具有推广应用价值。2.连作苹果园土壤中酚酸类物质的组成和含量在不同季节、不同位置和不同土层存在显著差异。连作苹果园土壤中酚酸类物质的含量从春季到秋季随时间的延长逐渐增加,是一个长期积累的过程。磁窑、道朗和金城连作苹果园土壤中均表现为树穴具有最高的土壤酚酸含量,尤其在秋季树穴酚酸总量分别为行间的5.080倍、5.010倍和1.700倍。春季土壤酚酸主要分布在浅层土壤,夏秋两季则主要分布在深层土壤。调查结果显示根皮苷、苯甲酸、水杨酸、根皮素和香草醛是引起磁窑、道朗和金城苹果园连作障碍的主要酚酸类物质。不同取样地点比较,以道朗行间的再植幼树长势最好。不同取样位置比较,原树穴的再植幼树株高、干周长、分枝数都低于原行间。3.土壤实测浓度的根皮苷、根皮素、苯甲酸、香草醛、水杨酸及五种酚酸混合物对平邑甜茶幼苗生物量、根系活力、根系线粒体相关指标、叶片保护性酶、根系TCA循环酶的影响总体表现为抑制作用,五种酚酸混合物抑制作用最大。各处理对平邑甜茶幼苗的生物量抑制大小排序为：混合酚酸>根皮苷>根皮素>香草醛>水杨酸>苯甲酸。与对照相比,根皮苷、根皮素及苯甲酸处理后达显著差异的根系蛋白质点分别有16种(10种上调,6种下调)、13种(5种上调,8种下调)、9种(3种上调,6种下调)；被鉴定的蛋白质按其功能分为：信号转导相关蛋白、病原相关蛋白、代谢相关蛋白、自由基清除相关蛋白、逆境相关蛋白等8大功能类群。4.三片连作苹果园的土壤真菌多样性存在差异,各采样地区的Shannon多样性指数在0.430-2.470之间,Pielou均匀度指数在0.170-0.850之间,Simpson优势度指数在0.120-0.810之间,Margalef丰富度指数最高的是金城树穴0-30cm土层(R=4.550),最低的是磁窑行间30-60cm土层(R=0.770)。在调查的不同取样位置、不同土层中,原树穴具有最高的多样性指数、均匀度指数、丰富度指数和最低的优势度指数。0-30cm土层的土壤真菌多样性指数、均匀度指数、丰富度指数均高于30-60cm土层,而优势度指数的趋势正好相反。PCA和聚类分析结果显示磁窑、道朗和金城连作园的土壤真菌群落结构均有明显差异,3个连作园的土壤真菌各自构成一个独立的群落结构。并对三片连作园的树穴土壤进行ITS克隆文库分析,研究发现连作果园中存在致病真菌属,包括柱孢属、镰孢属等致病真菌属。5.用碳化硅量子点标记技术成功地实现了对串珠镰孢菌的标记及40天的长时程示踪,标记过程中荧光显微镜下拍照结果显示,串珠镰孢菌在无根皮苷环境中生长较慢、分裂迟缓,而在含有根皮苷环境中生长很快、分裂迅速。0.500mmol/L、1.000mmol/L浓度下,根皮苷可以促进串珠镰孢菌的生长；平板培养实验证明土壤实测浓度的根皮苷等酚酸类物质均可促进串珠和尖孢镰孢菌的生长。盆栽实验证明土壤实测浓度的根皮苷等酚酸类物质均增加了土壤真菌的多样性,使土壤真菌群落的结构发生重大变化。
【作者】尹承苗；
【导师】毛志泉；
【作者基本信息】山东农业大学，果树学，2014，博士
【关键词】连作苹果园；酚酸分布规律；根系蛋白质组；土壤真菌多样性；

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