银杏雌雄花芽差异表达基因研究

【摘要】银杏原产中国，有世界“金色活化石”之称，为典型的雌雄异株植物，适应性强，种植范围广泛，集材、果、药、观赏多功能于一体，具有较高的经济价值和生态效益，在国内外市场供不应求。银杏雌雄株的生长习性、形态特征与用途各不相同，雄株常用作绿化中的行道树，而雌株则以果实的生产为主要目的。银杏雌雄株的选择往往受制于童期长、性别分化和性别表现较迟的影响，在其生长早期不能正确地区分。因此，准确的鉴定银杏性别，在生产实践中意义重大。二十世纪以来，随着分子生物学及生物技术的迅猛发展，已利用遗传标记对银杏的性别决定及遗传机制有了一些了解，但有关性别基因的确定及调控机理方面的研究少见报道，利用分子生物学的方法分离性别相关基因仍需大量的研究工作。抑制差减杂交（SSH）技术因其假阳性率低、高效灵敏、经济速度、重复性好等特点，近年来已作为一种高效便捷鉴别差异表达基因的方法，取得许多研究成果，并已广泛应用于分子遗传学及定向克隆的研究中。基于以上原因，本研究应用分子生物学、生物信息学及实时定量分析等方法技术，分别以银杏雌、雄花芽为材料，构建银杏雌雄花芽抑制性差减文库，通过对差减cDNA文库所包含的所有序列进行生物信息学功能注释和分类，筛选与银杏性别调控相关的ESTs，继而对这些ESTs进行表达分析及检测。集中研究这些ESTs在银杏雌雄株花器官发育中的差异表达，为进一步探讨银杏雌雄株性别分化的机理奠定理论基础，也为后续银杏花发育相关基因的克隆、表达和功能分析工作打下基础。主要研究结果如下：1.首次应用SSH技术成功构建了银杏雌雄花芽差异表达的正反向两个差减cDNA文库，文库片段插入率接近95%，插入片段的大小主要分布在300-1300bp之间，平均长度在750bp左右。差减文库的成功构建为进一步筛选及克隆与银杏性别相关的基因奠定了基础，对银杏性别鉴定研究的分子机制具有重要意义。2.利用NCBI网站BLASTn软件，将银杏雌雄花芽差减文库筛选得到的差异基因ESTs片段序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，获得的功能注释序列通过GO分类体系进行初步生物信息学分析。结果雌花芽优势表达序列中有23.91%得到了同源序列，雄花芽优势表达序列中有58.42%比对得到了同源序列，总体超过半数的差异表达EST序列没有获得功能注释，参与光合作用、能量代谢等的保守基因序列占10%左右，同源基因获取率低。3.将差异基因ESTs与本实验室之前的银杏叶片RNA-seq测序的结果进行比对后，再一次提交BLASTn比对，结果显示，超过80%的序列获得了功能注释，明显提高了同源基因获取率。得到的雌雄花芽差异ESTs按照生物学功能分类共分为：功能未知、能量代谢、光合作用、信号转导、转录调控、蛋白质代谢和折叠、脂代谢、次生代谢、氨基酸代谢、细胞壁重塑、细胞骨架重塑、转运、抗性与逆境相应、糖代谢、核苷酸代谢和细胞周期与细胞生长，共16类。其中，核苷酸代谢为雌花芽特有，细胞周期与细胞生长为雄花芽特有。雌、雄花芽共有14个功能类别，说明同样作为花器官的前体和旺盛生长的组织，雌雄花芽在基因表达和代谢状态上具有一定的相似性，同时也存在特异性。由此可见，银杏雌雄花芽发育过程中，伴随着复杂多样的生理生化过程。4.差减文库中筛选到8个可能控制植物花器官发育及配子体形成相关基因的ESTs，如Dof家族转录因子通过抑制CO基因的转录可以延迟拟南芥植株开花；CRT蛋白参与某些植物花柱道的发育和双受精过程；PAE通过调节细胞壁的代谢，参与植物花粉发育过程；PLD具有促进细胞扩展的作用，参与植物花粉管极性生长等过程；PAL基因的突变会造成花粉活力丧失；SHEPHERD基因的突变会抑制花粉管的极性伸长等。另外，从差减文库中筛选到5类激素相关基因，如Beta-葡糖苷酶能够活化CTK分子；ETH信号转导相关序列；DWARF基因负责GA的合成等。这些ESTs功能的分析和验证，为分析银杏雌雄花基因的表达，以及进行转基因研究调控花的发育奠定基础。5.从雄性和雌性花芽优势表达序列中各鉴定到数个ATP合成酶编码基因，在雄性花芽优势表达序列中发现1个WD家族蛋白编码的基因。这些序列有可能作为SlY-1或者DD44的同源基因而定位于性染色体上，是在性别决定过程中发挥关键调控作用的基因。6.差减文库中筛选得到3个与动物性别决定基因相关的ESTs：Sex-lethal介导雌性特异剪接、起始和维持雌性特征的发育；导致小鼠雄性连锁的腭裂的CASK基因和小鼠维持雄性性征的H-Y基因。思考，植物性别决定和动物的性别决定是否存在部分共同的机制联系。7.采用Real-timePCR方法，从银杏雌雄花芽正反差减文库筛选的差异ESTs中，随机挑选15个，研究来自银杏雌雄花芽中差异基因的表达情况。结果表明，7个雌性花芽优势表达序列在雌性花芽中的表达量明显高于雄性花芽，1个雌性花芽优势表达序列表达量较低，且在雌雄花芽之间差异不明显。7个雄性花芽优势表达序列均表现出在雄性花芽中明显高于雌性花芽的表达模式。验证了抑制性差减杂交得到的差异表达序列的可靠性。8.检测差异表达序列在银杏雌性和雄性基因组中的分布情况发现，大多数序列没有在雌、雄基因组之间表现出分布差异。CH11和CH15在雄性基因组扩增得到的信号大致为雌性基因组的2倍，可能是定位在Z和W染色体上的基因，推测CH15和CH11为定位于W染色体的雌性特异区域，且在Z染色体上具有同源基因的序列。
【作者】张晓文；
【导师】邢世岩；
【作者基本信息】山东农业大学，森林培育，2014，博士
【关键词】银杏；差异表达基因；抑制差减杂交；性别决定；

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