妊娠早期叶酸缺乏对仔猪骨骼肌mRNA表达谱的影响及其表观遗传机制研究
【摘要】孕期叶酸缺乏（folatedeficiency,FD）能够引起胎儿宫内发育迟缓（intrauterinegrowthretardation,IUGR），而骨骼肌发育不良是IUGR的主要表征。然而，叶酸缺乏对骨骼肌发育的影响及其分子机制还不明确。近年来，提高肉质水平已成为21世纪养猪业及育种专家新的攻关方向；在人类孕前孕后补充叶酸对后代的长远影响已受到专家的质疑并将成为新的研究热点。本研究探讨叶酸的缺乏及补充对骨骼肌形成及发育的影响，旨在为肉质改善和临床叶酸营养提供有力的实验支持。首先，我们以猪为动物模型，观察孕早期叶酸缺乏对仔猪骨骼肌性状及mRNA表达谱的影响。在我们的研究中，全同胞关系的长白猪与莱芜猪作为杂交体系，在怀孕0-6个月喂养叶酸缺乏饲料或正常饲料，观察初生仔猪背最长肌（Longissimusdorsi,LD）性状并收集标本，用4×44KAgilent猪芯片进行表达谱检测。无论在正交组（LR♂×LW♀）还是反交组（LW♂×LR♀），叶酸缺乏组出生仔猪体重均低于正常对照组，而对仔猪体长体高无显著影响；叶酸缺乏组仔猪肌纤维密度降低，LD中甘油三酯含量更高。芯片结果显示在LR♂×LW♀叶酸缺乏组与对照组比较，子代LD中有3154个基因差异表达，而反交组有3885个差异基因（differentiallyexpressedgenes,DEGs）；结果还表明在正反交之间叶酸主要通过影响不同的差异基因而发挥作用。功能分析表明，孕期母猪叶酸缺乏影响了仔猪LD中几乎所有的生物学过程；GO与KEGG筛查出脂肪发育及脂代谢相关的基因与通路，说明母猪叶酸缺乏可能通过调控相关基因而影响了仔猪的脂肪沉积。另一方面，C2C12细胞株在低血清诱导条件下能够分化为多核的肌管，是体外研究成肌细胞增殖和分化的首选模型。我们以C2C12为模型，分别研究叶酸对成肌细胞增殖及分化的影响并探讨其可能的机制。C2C12培养于乏叶酸培养基D2429中来观察叶酸对肌形成的影响。根据叶酸浓度分成三个组：叶酸缺乏组（Folate-0mg/l，L），正常叶酸浓度组（Folate-4mg/l，N）及高叶酸浓度叶酸组（Folate-40mg/l，H）。我们首先研究叶酸对C2C12增殖及分化的影响，结果发现叶酸缺乏能够促进C2C12细胞增殖而抑制其分化，而高浓度叶酸能促进C2C12的增殖及分化。在C2C12增殖过程中，正常组MyoDmRNA表达明显高于叶酸缺乏与高浓度叶酸组（P<0.05）。通过亚硫酸盐测序（bisulphitesequencing，BS）发现MyoD转录起始位点（Transcriptionstartsite，TSS）上游-16bpto+26bp中的5个CpG位点在H组高甲基化，在N组低甲基化。在C2C12分化过程中，我们发现随着叶酸浓度的升高MyogeninmRNA表达增强；在检测的-374bpto+6bp380bp中，靠近TSS的第7和第8CpG位点在高H组高甲基化，而在L组第5和第9位点高甲基化，在L组第2、3、4位点高甲基化；Myogenin第一外显子区甲基化情况在三组之间没有明显不同。叶酸可能正是通过影响基因启动子区CpG位点甲基化情况而影响MyoD和Myogenin的表达。我们进一步利用MeDIP-chip技术检测了叶酸对C2C12分化过程中全基因组甲基化的影响。结果表明每两组之间启动子区和CpG岛区都存在大量差异甲基化区域（differentiallymethylatedregions,DMRs）。启动子区的DMRs又根据CpG含量分为HCP、ICP及LCP，在各组之间DMRs主要是HCP；各组之间CpG岛中的DMRs主要位于启动子区CpG岛中。在NvsL之间启动子区共有180DMRs（84hypermethylatedand96hypomethylated），在HvsL之间共有199DMRs（95hypermethylatedand104hypomethylated），在HvsN之间共有201DMRs（104hypermethylatedand97hypomethylated）。在甲基化谱中NvsL与HvsL存在较多的commonDMRs；而无论是甲基化上调还是甲基化下调的DMRs比较，NvsL与HvsL之间commonDMRs均较少。对DMRs所在基因进行功能分析表明NvsL的DMRs主要富集于细胞分化及发育过程，而HvsL的DMRs更多富集于细胞周期及各种细胞代谢过程。说明从叶酸缺乏状态补充到正常叶酸浓度状态，与从正常叶酸浓度补充到高浓度叶酸状态是通过调控不同基因甲基化状态及不同的生物学过程而影响C2C12的分化。对甲基化谱及表达谱关联分析表明，DMRs与DEGs之间存在一些关联基因，也就是说在C2C12分化过程中，不同浓度叶酸对基因启动子区甲基化的影响可能是一些基因差异表达的直接原因；另一方面，我们可以看出两组之间的DMRs并不是DEGs的唯一原因，即在不同浓度叶酸条件下引起的基因差异表达是各种调控综合作用的结果。总之，本研究结果显示孕期叶酸缺乏能够改变仔猪背最长肌的基因表达从而影响仔猪骨骼肌的形成，并且母猪叶酸缺乏能够影响仔猪的脂肪沉积。另一方面，体外细胞水平研究发现叶酸缺乏与补充能够影响C2C12的增殖及分化，DNA甲基化是叶酸调控骨骼肌形成的重要机制之一。本研究将为肉质改良及叶酸营养研究提供遗传学和表观遗传学研究基础。
【作者】李毅；
【导师】姜运良；
【作者基本信息】山东农业大学，动物遗传育种与繁殖，2014，博士
【关键词】骨骼肌形成；叶酸；DNA甲基化；C2C12细胞；母猪；
【参考文献】
[1]张汝新.健康老年人颈动脉超声结构和功能随增龄变化的研究[D].中国医科大学,内科学,2004,硕士.
[2]王金水,杨森,尹艳丽,张艳杰,冯景丽,周晓配.植物乳酸菌M616对发酵酸面团发酵特性的影响[J].现代食品科技,2015,04:.
[3]刘萍.葡聚糖—聚（乳酸—羟基乙酸）嫁接物的合成及其紫杉醇胶束的抗肿瘤活性研究[D].浙江大学,药剂学,2013,硕士.
[4]李甜甜,何卫力,郝荣霞.K_(1,4)梯图的可定向嵌入亏格分布[J].数学进展,2015,01:37-46.
[5]白婧婧.五轴注塑机械手手控器软件设计[D].西安电子科技大学,控制理论与控制工程,2012,硕士.
[6]杨文博.零售业数据挖掘的再认识[J].商业时代,2004,11:10-11.
[7]李莉.京东易学思想要义[D].西北大学,中国哲学,2013,硕士.
[8]陈玉明.深圳地铁一期工程项目管理实践与思考[J].城市轨道交通研究.2006(04)
[9]张煜.衰减磁场和r-模制动诱导的中子星化学加热研究[D].华中师范大学,天体物理,2013,硕士.
[10]胡玮璇.北运河水体主要污染碳源的确定及其对同步硝化反硝化影响的模拟研究[D].首都师范大学,环境科学,2014,硕士.
[11]邱阳阳.基于弹塑性有限元法的沥青路面局部应变与疲劳寿命预估[D].长安大学,道路与铁道工程,2013,硕士.
[12]卞晓波.花后开放式增温对小麦籽粒形成的影响及其生理机制[D].南京农业大学,作物栽培学与耕作学,2012,硕士.
[13]张雪,池宏,刘博伦.基于题目反应模型的应急团队能力评估方法[J].管理评论,2014,04:93-100.
[14]唐敏.四川大西洋集团公司战略研究[D].西南财经大学,工商管理,2003,硕士.
[15]陈星莺,李刚,廖迎晨,余昆.考虑环境成本的城市电网最优潮流模型[J].电力系统自动化,2010,15:42-46.
[16]杨莹.《西游记》与《最游记》比较研究[D].湖北大学,中国现当代文学,2011,硕士.
[17]蒋晓燕.我国大宗农产品价格波动及稳定研究[D].宁波大学,金融学,2013,硕士.
[18]张菲菲.深圳市超高密度居住社区特征及其成因研究[D].深圳大学,城市规划与设计,2014,硕士.
[19]朱光.三扬独立热电联产能源系统项目风险控制研究[D].西北大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[20]牛忠华.导航数据处理器的软硬件设计及实现[D].西安电子科技大学,电路与系统,2010,硕士.
[21]李维娟.学术讲座与研讨会中四字词束的功能分布特征[D].兰州理工大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[22]李敏纳,蔡舒,覃成林.中美西部人口资源开发的比较及启示[J].河南大学学报(社会科学版),2014,04:37-45.
[23]庞博.批量MEMS陀螺信息融合技术研究[D].哈尔滨工业大学,飞行器设计,2013,硕士.
[24]赵春艳.新世纪以来日本政治大国战略的实践及其对中日关系的影响研究[D].兰州大学,国际关系,2013,硕士.
[25]于帆,李纪鑫.免疫算法在近红外光谱奇异样本识别中的应用[J].西安工业大学学报,2014,01:38-43.
[26]全琳.西部机场集团母子公司管理控制模式研究[D].西北大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[27]肖莉.归脾汤加减治疗神经性皮炎（心脾两虚型）临床疗效观察[D].成都中医药大学,中医外科学,2012,硕士.
[28]刘国庆.基于钢轨闪光焊闪光声音信号的采集与分析[D].西南交通大学,材料加工工程,2013,硕士.
[29]高扬.LTE-A中继关键技术研究及仿真实现[D].河北大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[30]尤克民.丝素蛋白多孔支架联合硫酸软骨素酶ABC治疗大鼠脊髓损伤[D].苏州大学,骨外科学,2014,硕士.
[31]汪茜.论情势变更原则[D].云南财经大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[32]陈宗丽.农民参加现代农业技术培训的现状、问题及对策研究[D].南京农业大学,教育经济与管理,2011,硕士.
[33]王伟,曲志及.北京地铁5号线车辆制动设备模块化设计[J].城市轨道交通研究.2008(05)
[34]杨天悦.自由的混搭艺术[D].华东师范大学,视觉传达,2012,硕士.
[35]张承江.肾病中医治疗信息分析与挖掘技术的研究[D].黑龙江大学,2004.
[36]田甜.生酮饮食对新生期反复惊厥远期神经行为损伤及发芽相关分子表达的影响[D].苏州大学,儿科学,2013,硕士.
[37]王书业.既有居住区外部环境更新研究[D].郑州大学,建筑设计及其理论,2013,硕士.
[38]于常友.采用电子技术武装钢铁工业[J].冶金自动化,1992,06:3-4+10.
[39]董倩.比亚迪G6汽车密封条试生产项目质量管理研究[D].吉林大学,项目管理,2014,硕士.
[40]赵婧.简欧风格在新东亚会所室内设计中的应用研究[D].河北大学,艺术（专业学位）,2014,硕士.
[41]杨铖,索南加乐,李亚利.基于R-L模型的单相重合闸线路故障测距方法[J].电力系统自动化,2010,10:71-75.
[42]胡清.制浆蒸煮过程的清洁生产综合自动化技术研究[D].广东工业大学,2008.
[43]王忠艳.基于FRFT的双随机相位数字水印方法研究[D].哈尔滨工业大学,应用数学,2013,硕士.
[44]王旭浈.运用真实世界研究方法研究原发性失眠症的临床用药规律[D].北京中医药大学,中医学,2014,硕士.
[45]黄伟.对网络外部性的研究及其在商业策略中的应用[D].西北工业大学,马克思主义理论与思想政治教育,2004,硕士.
[46]李彩玲.三维模型重建、修复及优化算法研究与实现[D].首都师范大学,计算机应用,2013,硕士.
[47]翟全国.铯盐—混合溶剂体系平衡溶解度及其相关系研究[D].陕西师范大学,分析化学,2004,硕士.
[48]贺叶露,赖于树,舒纯军,许刚.纳米石墨片的场发射性能研究与应用[J].西南大学学报(自然科学版),2013,01:99-103.
[49]张磊.个性化推荐和搜索中若干关键问题的研究[D].北京邮电大学,2009.
[50]廖蔚,聂雪娥.YKGX-1油库微机控制管理系统[J].电讯技术.1993(01)
