MAPK信号转导通路在胃泌素调节大肠癌生长中的作用及其分子机制研究

【摘要】胃泌素（Gastrin，GAS）最早于1905年由John在胃窦黏膜提取物中发现，并认为其与胃酸分泌有关，直到1964年才由Gregory和Tracy分离鉴定并阐述其化学结构，确认其为胃肠激素。胃泌素是一种重要的胃肠激素，主要由消化道的G细胞分泌，G细胞是典型的开放型细胞，以胃窦部最多。作为一种营养性胃肠肽，不仅能刺激正常胃肠道黏膜组织的生长，而且还能刺激胰腺癌、胆囊癌、大肠癌及胃癌等肿瘤细胞的生长。近来众多研究认为胃泌素是一种自分泌生长因子，它可以通过自分泌、旁分泌、神经内分泌等方式发挥作用。胃泌素与其受体结合后可通过细胞内信号传导途径调节肿瘤细胞的生长，即肿瘤细胞产生的胃泌素与其自身的受体结合后，发挥其生物学效应。近年来研究已证实部分大肠癌的发生与胃泌素表达异常有关，这一类大肠癌有学者把它们称为激素依赖性肿瘤，其促进大肠癌细胞增殖的机制可能是通过自主性地产生和分泌胃泌素并作用于自身细胞膜上的受体，从而发挥生物学效应，但其作用能被胃泌素受体拮抗剂所抑制，但胃泌素调节大肠癌细胞增殖的分子机制仍不清楚。近年来，通过应用基因芯片技术对大肠癌相关基因检测，筛选出大量差异表达基因,在显著差异表达的基因中,许多与细胞内外网络信号转导通路的激活与抑制密切相关，直接参与细胞的物质代谢、增殖、分化和凋亡的调节。有关丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信息转导通路的研究近来倍受关注，MAPK是细胞内一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛存在于大多数哺乳动物细胞质和细胞核中，能够将细胞外刺激信号传导至细胞内及细胞核内，并引起细胞生物学反应,调节细胞的增殖、分化、发育和凋亡。丝裂原活化蛋白激酶主要分为细胞外信号调节激酶(extracellular-signalregulatedproteinkinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶（c-JunN-terminalkinase，JNK）/应激活化蛋白激酶（stress-activatedproteinkinase，SAPK）、ERK5/BMK1和p38等MAPK亚族，这些亚族组成多条信号转导通路。目前研究已发现哺乳动物类细胞存在三条并行的丝裂原活化蛋白激酶信号通路，分别为为ERK信号通路、p38信号转导通路和JNK/SAPK信号转导通路。其中，JNK/SAPK和p38两条信号转导通路主要与细胞的凋亡和应激有关，而ERK信号通路在MAPK细胞信号转导网络中处于枢纽地位，它主要与细胞的增殖和分化密切相关。众多的研究提示MAPK信号转导通路参与了大肠癌细胞生长的调控。近来研究发现，胃泌素可通过激活p38MAPK信号转导通路诱导大肠癌细胞尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)表达，进而增强肿瘤细胞的侵袭力和转移过程。可见，丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路在胃泌素调节大肠癌生长中起着重要作用，但其机制仍不清楚。因此我们设想首先运用ELISA法对79例大肠癌手术切除标本检测，筛选出胃泌素表达阳性及阴性的大肠癌组织标本，并对其阳性表达率、组织病理类型、分化程度及临床Duke’s分期进行分析，明确胃泌素对大肠癌生物学特性的影响。其次，分别选择5对胃泌素表达阳性的大肠癌组织及癌旁正常粘膜组织，以及5对胃泌素表达阴性的大肠癌组织及癌旁正常粘膜组织，利用基因芯片技术分别对其差异基因表达谱进行分析，将阳性组与阴性组分析结果进行比较，筛选出表达明显差异的基因，并选择明显表达差异的基因进行real-timePCR验证，同时将明显表达差异基因导入Rpackage中，筛选出与MAPK信号转导通路相关的差异基因。最后，通过大肠癌细胞株HT-29的培养，应用Westernblot、RT-PCR等技术分别对各组已筛选出MAPK信号转导通路明显相关的差异基因及其蛋白表达情况进行检测，并分析胃泌素在其受体拮抗剂丙谷胺阻断其前后对其表达变化影响，从分子信号传导水平探索大肠癌组织中胃泌素调节MAPK信号转导通路的分子机制；明确“GAS-MAPK-靶基因”信号转导通路在胃泌素调节大肠癌生长中的详细分子基础，为有效地干预其信号转导通路环节提供新的线索，为基因靶向治疗提供新目标，并为大肠癌的内分泌治疗提供更充分的理论依据。研究分三个部分：第一部分：大肠癌组织中胃泌素表达检测及生物学行为分析目的：探讨大肠癌组织中胃泌素阳性表达率以及胃泌素对组织病理类型、分化程度及临床Duke’s分期等大肠癌生物学特性的影响。方法：运用ELISA法和RT-PCR技术对79例大肠癌手术切除标本检测，筛选出胃泌素表达阳性及阴性的大肠癌组织标本，并对其阳性表达率、组织病理类型、组织分化程度及Duke’s分期进行分析。结果：79例大肠癌组织中GASmRNA表达阳性率为46.8％(36/79)，蛋白表达阳性率为40.5％(32/79)；GASmRNA与其蛋白表达呈正相关（r=0.99,P<0.01）。GASmRNA及其蛋白在高、中分化组织的阳性表达率明显低于低分化（P<0.05）。GASmRNA及其蛋白在乳头状腺癌、管状腺癌的阳性表达率明显低于粘液印戒细胞癌及未分化癌（P<0.05）。DukesA,B期的GASmRNA及其蛋白阳性表达率明显低于C,D期（P<0.05）。结论：部分大肠癌组织中存在胃泌素的表达，胃泌素的异常表达与组织分化程度、病理类型及临床Duke’s分期密切相关，胃泌素检测能够反应部分大肠癌的生物学特性，可作为临床大肠癌生物学行为的评估指标之一。第二部分：胃泌素表达阳性与阴性的大肠癌组织中MAPK信号转导通路差异基因筛选目的：探讨胃泌素表达阳性与阴性的大肠癌组织中MAPK信号转导通路相关差异基因表达。方法：应用基因芯片技术分别对大肠癌胃泌素表达阳性的癌组织、癌旁正常组织以及大肠癌胃泌素表达阴性的癌组织、癌旁正常组织中MAPK信号通路相关的差异基因表达谱进行分析，并将两组分析结果进行比较，筛选出表达明显差异的基因，并选择明显表达差异的基因进行real-timePCR验证，同时将所有差异表达基因导入Rpackage中，筛选出与MAPK信号转导通路相关的差异基因。结果：胃泌素表达阳性的癌组织与癌旁正常粘膜组织基因芯片分析结果显示：上调2倍以上的差异基因有3529个，下调2倍以下的差异基因3328个；胃泌素表达阴性的癌组织与癌旁正常粘膜组织基因芯片分析结果显示：上调2倍以上的差异基因有2867个，下调2倍以下的差异基因2549个。将两组分析的差异基因以癌组织的荧光值标记，并进行与胃泌素相关的差异基因分析，结果显示：上调2倍以上的差异基因有567个，下调2倍以下的差异基因342个。并筛选出与MAPK信号转导通路相关的差异基因78。分别选择上调和下调基因各3个进行基因验证，验证结果显示：PCR与芯片分析结果基本一致。结论：cDNA微阵列法可以用于胃泌素相关的大肠癌的相关基因的筛选，获得的差异基因具有强烈的代表性。大肠癌组织中胃泌素表达阳性与阴性之间存在着差异基因的表达；MAPK信号转导通路参与了胃泌素对大肠癌细胞生长的调控。第三部分：MAPK信号转导通路在胃泌素调节大肠癌细胞增殖与凋亡中的作用及机制目的：探讨胃泌素对体外培养的人大肠癌细胞株HT-29增殖、凋亡的影响，以及与MAPK信号转导通路的关系。方法：通过体外对大肠癌HT-29细胞株的培养，分别运用MTT法观察细胞增生活力改变情况，确立5-肽胃泌素（pentagastrin,PG）和丙谷胺(proglumide,PGL)处理HT-29细胞的最佳浓度；流式细胞仪AnnexinV-FITC法检测各组细胞增殖指数(proliferationindex,PI)及凋亡率(apoptosisrate,AR)的变化；RT-PCR检测大肠癌HT-29细胞株胃泌素受体CCK-BRmRNA表达情况以及各组ERK1/2、K-ras、p38、bax、bcl-2mRNA表达水平的变化；Westernblot法检测ERK1/2、K-ras、p38、bax、bcl-2蛋白表达及其ERK1/2、K-ras、p38磷酸化水平。结果：胃泌素浓度在6.25～100.00mg/L范围内能促进大肠癌HT-29细胞的增殖抑制凋亡，且度增加到25.00mg/L时OD值最大，促增生能力最强（P<0.05）；胃泌素受体拮抗剂丙谷胺单独对大肠癌HT-29细胞增殖、凋亡无明显影响，但丙谷胺在一定浓度范围内(8.00～128.00mg/L)能明显拮抗胃泌素促进HT-29细胞的增殖作用,其最佳浓度为32.00mg/L（P<0.05）。胃泌素组细胞增殖指数显著高于对照组和胃泌素+丙谷胺组（P<0.01）；胃泌素组凋亡率显著低于对照组和胃泌素+丙谷胺组（P<0.05）；HT-29细胞中存在明显的CCK-BRmRNA表达；PG组(0.43±0.04,0.45±0.06)与对照组(0.32±0.02,0.31±0.05)及PG+PGL组（0.36±0.01，0.35±0.04）相比，ERK1/2、K-ras磷酸化水平明显升高，而p38磷酸化水平明显降低（P<0.05），ERK1/2、K-ras及p38mRNA及蛋白表达无明显差异；胃泌素组与对照组和胃泌素+丙谷胺组比较baxmRNA及蛋白表达明显降低、Bcl-2mRNA及蛋白表达明显增高（P<0.05）。结论：胃泌素能够促进大肠癌HT-29细胞增殖、抑制凋亡，但能被其受体拮抗剂丙谷胺抑制。其机制可能是通过激活ERK-MAPK信号通路中Ras→Raf→MEK1/2→ERK1/2途径促进大肠癌HT-29细胞增殖；通过激活p38-MAPK信号通路中p38MAPK→bcl-2/bax途径抑制大肠癌HT-29细胞凋亡。
【作者】茆家定；
【导师】钱海鑫；
【作者基本信息】苏州大学，普外科（专业学位），2013，博士
【关键词】胃泌素；基因芯片；MAPK；丙谷胺；大肠癌；

【参考文献】
[1]周兴龙,王文潜,张文彬.石英单矿物斜窄流单元分级试验研究[J].金属矿山.2004(11)
[2]饶威治.民办高校辅导员岗位离职问题探究[D].华侨大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[3]王娇.论教师语言的语用失误问题[D].吉林大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[4]魏维.长沙市土地低碳利用研究[D].湖南师范大学,土地资源管理,2014,硕士.
[5]苏文崎.新型罗丹明类荧光探针的合成及对金属离子的选择性识别研究[D].西北大学,有机化学,2013,硕士.
[6]马骥葵.宋仁宗朝诗歌研究[D].黑龙江大学,中国古代文学,2014,博士.
[7]王青.视频跟踪的粒子滤波算法研究与实现[D].东北大学,计算机软件与理论,2010,硕士.
[8]张彬.磁性氧化石墨烯—壳聚糖纳米复合材料固定化的脂肪酶及其应用[D].兰州理工大学,2013.
[9]丛丹丹.新世纪好莱坞歌舞片探究[D].河北大学,广播电视艺术学,2014,硕士.
[10]姜坤.太湖水环境约束下的宜兴市土地利用分区研究[D].南京农业大学,土地资源管理,2012,硕士.
[11]刘丹.汉英网络委婉语的比较研究[D].湖北工业大学,外国语言学及应用,2014,硕士.
[12]王宇峰.小流量涡轮轴发动机动力涡轮导叶弯叶片设计[D].哈尔滨工业大学,动力工程（专业学位）,2013,硕士.
[13]顾愿愿,潘道东,孙杨赢,曹锦轩,曾小群.基于石墨烯-酪氨酸酶-壳聚糖快速检测BPA电化学酶传感器的研究与应用[J].现代食品科技,2014,12:210-214+193.
[14]董瑱琦.一个基于XPDL的LOTUS NOTES工作流引擎[D].上海交通大学,软件工程,2013,硕士.
[15]张涛.Q690人字柱与横撑相贯节点转动刚度研究[D].西安建筑科技大学,结构工程,2013,硕士.
[16]景莹莹.论海洋文化对海洋立法的影响[D].山东大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[17]吴松金.基于最优匹配度的大跨空间无上弦组合管桁架楼盖优化分析[D].长安大学,结构工程,2014,硕士.
[18]康钦钦.肾脏肿瘤的磁共振扩散加权成像研究[D].第二军医大学,影像医学与核医学（专业学位）,2013,硕士.
[19]蔡志全,曹坤芳,郑丽.6种热带雨林木本植物幼苗光合诱导的研究[J].植物生态学报,2003,05:617-623.
[20]殷开成.服装疵点检测的数字化表征[D].东华大学,2014.
[21]盛世玉.山东省社会保障水平研究[D].山东财经大学,社会保障,2013,硕士.
[22]赵阳,范慧涛.基于PLC的电器控制技术研究[J].电子制作,2015,13:26.
[23]关锌.地热资源经济评价方法与应用研究[D].中国地质大学,资源产业经济,2014,博士.
[24]符丹.大学生心理危机预警及干预研究[D].西北农林科技大学,职业技术教育学,2012,硕士.
[25]李吉,魏彤,闫俊,龙从来,范壮军.石墨烯纳米片/CoS_2复合材料的制备及其在超级电容器中的应用[J].化工学报,2014,07:2849-2854.
[26]刘佳.生活用纸生产谱系追溯信息系统开发[D].华南理工大学,制浆造纸工程,2014,硕士.
[27]万先虎.高温干湿交替环境下FRP-混凝土界面粘结性能的耐久性研究[D].哈尔滨工业大学,结构工程,2013,硕士.
[28]欧阳惠云.译者：翻译行为的主体[D].江西师范大学,英语语言文学,2004,硕士.
[29]王娟.同伴评估对大学生英语写作修改的有效性研究[D].广东外语外贸大学,外语教学技术与评估,2013,硕士.
[30]李健.论司法鉴定质量控制[D].西南政法大学,侦查学,2012,硕士.
[31]石毅.非开挖钻杆水浸超声检测方法与装备[D].华中科技大学,机械工程,2013,硕士.
[32]胡晓青.服装品牌中VI（视觉识别）的应用研究[D].青岛大学,设计艺术学,2013,硕士.
[33]赵明旺.连续可微函数全局优化的混合遗传算法[J].控制与决策,1997,05:589-592+597.
[34]张高勤.矿物增稠型的干粉砂浆性能的研究[D].南京林业大学,森林工程,2004,硕士.
[35]刘金帅.高校大学生党性问题研究[D].山东大学,学生事务管理与学生发展指导,2013,硕士.
[36]李玉峰.高精度三相多功能工业电能表的研究[D].安徽大学,检测技术与自动化装置,2013,硕士.
[37]任兰美.论虚假陈述行为人的法律责任[D].北方工业大学,法律,2013,硕士.
[38]刘鑫.论完善社会主义市场经济体制条件下企业文化建设的走向[D].吉林大学,公共管理,2004,硕士.
[39]曹杰.单层石墨烯的输运性质与拓扑性质研究[D].南京大学,理论物理,2014,博士.
[40]李微微.基于城市经营的城市竞争力研究[D].天津大学,企业管理,2004,硕士.
[41]尤翔宇.三维电极法处理EDTA废水的基础研究[D].中南大学,冶金工程,2013,博士.
[42]钟良鸣.女性意识与翟永明的诗歌创作[D].西南大学,中国现当代文学,2014,硕士.
[43]李明春,马欣,王小旭.WCDMA系统无线网络规划的若干问题[J].信息网络.2003(10)
[44]王福芝,谭占鳌,戴松元,李永舫.平面异质结有机-无机杂化钙钛矿太阳电池研究进展[J].物理学报,2015,03:44-61.
[45]郭嘉华.集资诈骗罪的再研究[D].湖南师范大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[46]董阳.华兹华斯在20世纪中国译介与接受史分析[D].上海外国语大学,英语语言文学,2012,硕士.
[47]桂启发.基于嵌入式系统的信息家电的开发与研究[D].武汉理工大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[48]史为涛.HBV X基因、前C基因变异及相关因素与HCC关系的研究[D].山西医科大学,内科学,2013,硕士.
[49]耿国庆.基于USB接口的指纹图像采集与处理的研究[D].首都师范大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[50]张宝珠.林奇主义的思考[D].中央美术学院,数码媒体,2013,硕士.