大鼠脊髓缺血再灌注损伤后自噬表达及作用的实验研究

【摘要】第一部分大鼠脊髓缺血再灌注损伤动物模型的建立与评价目的：建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型，观察不同缺血时间对脊髓缺血再灌注损伤后病理组织学和神经功能评分的影响。方法：构建大鼠胸主动脉球囊阻断复合体循环低血压（MAP=40mmHg)脊髓缺血再灌注模型，按不同的阻断时间随机分为假手术组、缺血8min组、10min组和12min组，评定再灌注24h和48h后神经功能；观察再灌注48h后脊髓形态学变化。结果：再灌注48h后，缺血8min、10min和12min组出现截瘫率分别为60％、100％和100％，各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。再灌注48h后，脊髓组织出现神经细胞肿胀、坏死等改变，且随阻断时间的延长，损伤程度逐渐加重。结论成功建立大鼠胸主动脉球囊阻断复合体循环低血压脊髓缺血再灌注模型。脊髓缺血10min是模型建立的最佳时间。第二部分细胞自噬及其相关蛋白Beclin-1，LC3和P62在大鼠脊髓缺血再灌注损伤组织中的表达目的：观察大鼠脊髓缺血再灌注损伤后损伤区细胞自噬是否存在，比较不同时间点细胞自噬的表达情况。方法：将大鼠随机分为两组，假手术组和缺血组，缺血组再分五个时间点：3H，6H，12H，24H，48H。损伤组按照第一部分的方法制作脊髓缺血再灌注损伤模型，假手术组只置入导管而不打开球囊损伤脊髓，按照上述时间点处死动物后，用透射电镜观察细胞自噬，用荧光双染法检测LC3及Beclin1在各时间点的表达和在各类脊髓组织细胞中的分布，Westernblot法检测自噬相关蛋白Beclin1，LC3和P62的表达情况。结果：透射电镜发现脊髓损伤后的各个时间点，在损伤的神经元细胞中可以发现自噬囊体和自噬溶酶体明显增加，脊髓损伤后3h开始，细胞自噬相关蛋白Beclin1和LC3表达即较对照组明显上调，并且随着时间持续升高，在伤后24h时达到高峰，伤后48h有回落，但仍高于基础值，而自噬相关蛋白P62表达下调表达，和Beclin1，LC3反相同步。缺血再灌注组Beclin1和LC3阳性细胞数在各时间点明显高于假手术组（p﹤0.05），趋势与蛋白变化相符。脊髓神经元细胞，胶质细胞，小胶质细胞中均有Beclin1和LC3表达。结论：1、脊髓缺血再灌注损伤中3H自噬表达明显上调，24H到达高峰，48H下降。神经元细胞、胶质细胞和小胶质细胞均可见自噬表达。自噬参与脊髓缺血再灌注损伤过程。第三部分自噬抑制剂3-MA对大鼠脊髓损伤后神经细胞自噬的影响目的：通过鞘内注射自噬抑制剂3-MA，观察自噬被抑制后对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后神经细胞自噬的影响。方法：将大鼠随机分成三组：假手术组，单纯缺血损伤组，3-MA组，每组分为伤后3H，12H，24H，48H各4个时间点，神经功能评分评价24h和48h小时后双下肢神经功能，脊髓前角神经元计数，Westernblot法检测自噬相关蛋白Beclin1，LC3和P62检测各组各时间点蛋白表达的变化，组织荧光免疫法检测各组Beclin1和LC3阳性细胞变化。结果：24H和48H后3-MA干预组较单纯缺血组神经功能评分显著改善（P＜0.05），在观测的的4个时间点上，3-MA治疗组脊髓前角神经元数明显多于单纯缺血组，Beclin1和LC3的蛋白上调表达和P62表达下调较单纯缺血组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。3-MA组Beclin1和LC3的阳性细胞数明显少于缺血损伤组，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：细胞自噬抑制剂3-MA可以明显改善大鼠脊髓缺血再灌注损伤后神经功能，增加神经元存活数，抑制自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62的表达。减少Beclin1和LC3阳性细胞数，抑制自噬具有神经保护作用。
【作者】魏兴；
【导师】董启榕；
【作者基本信息】苏州大学，外科学，2013，博士
【关键词】脊髓损伤；动物模型；神经功能评分；组织病理学；脊髓缺血再灌注损伤；自噬；Beclin1；LC3；P62；细胞自噬；3-MA；

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