人肺腺癌干细胞的分离、培养与鉴定及PI3K/AKT信号传导通路对其增殖及自我更新的影响

【摘要】第一部分PI3K/AKT信号传导通路蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义目的：探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其临床意义。方法：回顾性分析157例NSCLC患者的临床资料，其中鳞癌75例，腺癌82例，Ⅰ-ⅢA期70例，ⅢB-Ⅳ期87例，并收集30例手术切除肺癌癌旁组织标本。应用免疫组织化学方法检测PI3K和p-AKT蛋白在NSCLC癌组织和手术切除的肺癌癌旁组织中的表达，分析PI3K和p-AKT蛋白表达与NSCLC患者临床资料变量的关系，同时分析PI3K和p-AKT蛋白表达与ⅢB-Ⅳ期NSCLC预后的关系。结果：PI3K和p-AKT在Ⅰ-ⅢA期NSCLC中的表达明显高于癌旁组织（χ2=14.8455，P=0.000；χ2=14.2615，P=0.000）。p-AKT表达与Ⅰ-ⅢA期NSCLC的淋巴结转移、TNM分期呈正相关(χ2=6.1189,P=0.013，χ2=8.9752,P=0.011)，而与肿瘤的性别、年龄、病理类型、分化程度无关。p-AKT表达与ⅢB-Ⅳ期NSCLC的TNM分期呈正相关（χ2=5.7501,P=0.016），与肿瘤的性别、年龄、病理类型、分化程度、体力状态（PS）评分无关。PI3K表达与上述临床特征无关。在ⅢB-Ⅳ期NSCLC中，PI3K阴性表达组的中位数生存时间明显优于阳性表达组[17.699月(95%CI15.114-20.283)/13.426月(95%CI11.832-15.021)，P=0.004]，p-AKT阴性表达组的中位数生存时间明显亦优于阳性表达组[17.134月(95%CI14.927-19.341)/13.067月(95%CI11.316-14.817)，P=0.007]。多变量Cox’s回归分析显示PI3K[HR=2.143(95%CI1.211-3.790)，P=0.009]，p-AKT[HR=1.991(95%CI1.009-3.927)，P=0.047]，TNM分期[HR=4.788(95%CI2.591-8.848)，P=0.000]，PS评分[HR=3.272(95%CI1.701-6.296)，P=0.000]是ⅢB-Ⅳ期NSCLC的独立不利预后因素。结论：p-AKT与NSCLC不良预后因素密切相关，PI3K、p-AKT的高表达是晚期NSCLC预后的独立不利因素。第二部分人肺腺癌干细胞的分离、培养与鉴定目的：从人肺腺癌组织中分离、培养及鉴定具有干细胞特征的高致瘤性类肺癌干细胞。方法：采用磁性细胞分选(magneticactivatedcellsorting，MACS)技术从人肺腺癌组织单细胞悬液中分离CD133阳性细胞，无血清培养基富集CD133阳性细胞，流式细胞仪及免疫荧光检测富集后细胞的CD133的表达，并通过NOD/SCID小鼠移植评估其致瘤性。结果：人肺腺癌组织CD133阳性细胞成功分离，无血清培养法可用于分离的CD133阳性细胞的培养及富集，其具有自我更新，多项分化及高致瘤能力，在NOD/SCID小鼠中仅需移植100个细胞即可形成肿瘤。结论：MACS联用无血清培养法是人类肺癌干细胞分离和富集的有效方法。第三部分SiRNA沉默AKTl、PI3KP85基因对肺癌干细胞增殖及自我更新的影响目的：探讨RNAi(RNAinterference)技术下调肺癌干细胞中AKTl和PI3KP85亚基的表达对肺癌干细胞增殖和自我更新的影响。方法：实时荧光定量PCR检测肺癌干细胞中AKTl和PI3KP85mRNA的表达。将包含AKT1、PI3KP85两种siRNA开放阅读框的短发夹RNA(shRNA)重组腺病毒质粒表达载体rAd5-siAKTl-siPI3KP85转染至肺癌干细胞中。应用Westernblotting检测转染后目的基因蛋白的表达水平，并用Westernblotting检测目的基因被沉默后PCNA、cyclinD1和P53的表达情况。分别采用MTT增殖实验、细胞球形成实验和异种移植瘤形成实验观察各组差异，并用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期。结果：肺癌干细胞AKT1和PI3KP85亚基的mRNA表达明显高于肺癌原代细胞，重组腺病毒质粒表达载体rAd5-siAKTl-siPI3KP85介导的靶向AKTl，PI3KP85shRNA可以有效下调目的基因AKT1和PI3KP85的蛋白表达；下游相关因子PCNA、cyclinD1的表达亦下调，P53表达则上调。MTT增殖实验、细胞球形成实验和异种移植瘤形成实验发现肺癌干细胞增殖、自我更新、体外致瘤能力都显著降低。结论：AKTl和PI3KP85基因在肺癌干细胞高表达，靶向AKTl/PI3KP85亚基的shRNA技术可以抑制肺癌干细胞中AKTl、PI3KP85亚基的表达，抑制肺癌干细胞的体外增殖及自我更新能力。
【作者】江爱桂；
【导师】黄建安；
【作者基本信息】苏州大学，呼吸病学（专业学位），2013，博士
【关键词】非小细胞肺癌；磷脂酰肌醇3-激酶；磷酸化蛋白激酶B；预后；生存率；肺癌干细胞；肺癌；细胞分离；自我更新；AKTl；PI3KP85；

【参考文献】
[1]高淑子.普通话日母的音值[D].华东师范大学,语言学及应用语言学,2004,硕士.
[2]刘小燕,万腾腾.1990-2001年中国古代心理学研究的回顾与反思[J].上海师范大学学报(哲学社会科学.基础教育版),2004,04:117-121.
[3]李德娟.纤维素的RAFT接枝改性及其对纸浆的增强作用[D].齐鲁工业大学,制浆造纸工程,2014,硕士.
[4]曹景全.永磁直线电机负载运行法向力波动分析与优化设计[D].沈阳工业大学,电机与电器,2013,硕士.
[5]李嘉.地方政府网络舆情监管问题研究[D].内蒙古大学,公共管理,2014,硕士.
[6]叶蔚嫦.桥梁板式橡胶支座剪切模量检测方法研究及抗压弹性模量测试系统刚度分析[D].浙江工业大学,2005.
[7]丁明清.从石墨烯开关看电子在石墨烯中的奇异行为[A]..真空电子技术—陶瓷金属封接和真空电子与专用金属材料分会年会专辑[C].:,2013:5.
[8]楼斌.基于Markov模型的无线网络量化系统的H_(∞)滤波研究[D].杭州电子科技大学,系统工程,2013,硕士.
[9]张娟娟.甘肃省农村信用社发展问题研究[D].甘肃农业大学,区域经济学,2013,硕士.
[10]易斌,阮氏发.越南语单音节词声调特征的实验统计分析[J].民族语文,2014,03:45-53.
[11]刘园园.Needle trap-气相色谱法对地下水中有机磷分析方法研究[D].吉林大学,环境工程,2013,硕士.
[12]沈张锋,丁幸,任倩倩,王凌云,周春晖.萤石矿物选矿的技术创新[J].中国非金属矿工业导刊,2012,02:67-70.
[13]金在汉.韩国人参产业的国际竞争战略研究[D].对外经济贸易大学,企业管理,2004,硕士.
[14]鞠可一,周德群,吴君民.混合概念格在案例相似性度量中的应用[J].控制与决策,2010,07:987-992.
[15]方晗.肌母细胞分离纯化及flrg转基因细胞株构建[D].华中科技大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[16]袁莉.“人文”视野下的教师角色转换[D].四川师范大学,课程与教学论,2004,硕士.
[17]陈美莲.血必净注射液和乌司他丁治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重期合并全身炎症反应综合征的对比研究[D].福建中医药大学,中西医结合临床（专业学位）,2013,硕士.
[18]江苏经济报记者陈宁.创新创业：又酷又过瘾[N].江苏经济报,2015-05-20A01.
[19]姚俊.基于软测量技术的电机综合参数检测系统[D].浙江理工大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[20]杨志新.基于RT-Thread系统的网络时钟同步的实现与研究[D].南京邮电大学,仪器仪表工程（专业学位）,2013,硕士.
[21]董程程.基于XBRL财务报告的舞弊识别研究[D].山东财经大学,会计学,2014,硕士.
[22]李志强.粗集理论及其在网络故障诊断中的应用研究[D].河北工业大学,2004.
[23]窦晓雪.价值创造导向的上市商业银行内部控制框架研究[D].东北农业大学,会计学,2013,硕士.
[24]罗佳玲.行如流水，静如山岳[D].湖南师范大学,音乐学,2013,硕士.
[25]曹道胜,何明升.商业银行信用风险模型的比较及其借鉴[J].金融研究,2006,10:90-97.
[26]王俊,段斌,苏永新.基于尾流效应的海上风电场有功出力优化[J].电力系统自动化,2015,04:26-32+75.
[27]刘巍.基于内容的不良网页信息过滤方法研究[D].吉林大学,网络信息安全,2013,硕士.
[28]万裴琦.TGF-β1基因多态性及表达水平与广西人群肝癌家族聚集性的相关研究[D].广西医科大学,内科传染病学,2014,博士.
[29]杨东阳.转型时期中小型服装企业员工激励研究[D].北京交通大学,2013.
[30]周蕾.国术的近代调适[D].华中师范大学,中国近现代史,2014,硕士.
[31]邓彩莲.长春市农业银行个人消费信贷业务发展的思考[D].吉林大学,工商管理,2004,硕士.
[32]胡丰月.基于评价理论对《金融时报》文章的评价词汇研究[D].大连海事大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[33]王磊.所有权保留制度的理论与实践[D].华东政法学院,民商法学,2003,硕士.
[34]叶进,程泽凯,林士敏.基于贝叶斯网络的电信客户流失预测分析[J].计算机工程与应用,2005,14:212-214.
[35]李苗苗.中日钓鱼岛争端国际法解决途径探索[D].青岛大学,国际关系,2013,硕士.
[36]许志强.减肥套餐[J].经济论坛.1995(15)
[37]侯静.约翰·邓恩《歌与短歌集》中的爱情观[D].河北师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[38]王晓文.盐酸右美托咪定对急性心肌梗死患者行PCI治疗的心肌保护作用[D].苏州大学,内科学,2013,硕士.
[39]丁道齐.现代化电网运行管理中的安全与培训[J].电力系统自动化.1992(01)
[40]何梦昕.《法国中尉的女人》的互文性分析[D].河北师范大学,英语语言文学,2014,硕士.
[41]胡兴华.绿色交通概念解析[J].交通节能与环保,2015,02:56-60.
[42]刘洋,魏春,应向贤.结冷胶发酵研究进展[J].发酵科技通讯,2013,01:54-55.
[43]黄凤芝,井元伟.一类不确定离散Markov跳变系统滑模状态反馈控制[J].控制与决策,2011,10:1567-1570+1576.
[44]易珊.由虚拟到真实的社交网站界面设计研究[D].北京交通大学,2014.
[45]张荣.长春市400例儿童维生素D水平及影响因素初步探讨[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[46]王白丽.高校党建带团建的长效机制建设研究[D].华东师范大学,思想政治教育,2012,硕士.
[47]薄华,马缚龙,焦李成.图像数据挖掘的模型和技术[J].西安邮电学院学报,2004,03:81-85.
[48]孟强.我国煤矿企业思想政治教育工作问题及对策研究[D].中北大学,思想政治教育,2014,硕士.
[49]孙斌.天水地区现场暴露混凝土耐久性试验研究及寿命预测[D].兰州理工大学,结构工程,2014,硕士.
[50]刘亮.零售商业企业营销竞争力评价研究[D].新疆财经大学,企业管理,2013,硕士.