拟南芥VKOR蛋白在叶绿体光系统组装、信号转导及氧化还原调控中的功能分析

【摘要】植物叶绿体中的氧化还原调控在生长发育、基因表达调控、细胞信号转导和抗逆等生命活动中起非常重要的作用。巯基/二硫键的可逆转换作为一种典型的氧化还原反应,是叶绿体内一种非常重要的氧化还原调控手段。巯基/二硫键的可逆转换是由巯基氧化还原酶参与的酶催化反应。叶绿体中催化二硫键还原的酶类及性质已经有深入研究,而催化巯基氧化的酶类仍有待鉴定。对叶绿体中催化巯基氧化的酶类的鉴定及功能分析,有助于全面系统的理解叶绿体内巯基/二硫键的可逆氧化还原调控机理及其在叶绿体蛋白的转运及氧化折叠、类囊体复合体的组装和修复以及信号转导等生命活动中起的作用。最近在植物中发现了一种新的氧化还原酶—维生素K环氧化物还原酶(VitaminKepoxidereductase,VKOR),重组表达的拟南芥VKOR(AtVKOR)能够催化原核细胞蛋白质二硫键的形成,但VKOR基因在植物体内的功能尚不明确。本研究以筛选得到的拟南芥VKOR基因缺失突变体的纯合体、突变体补偿型和野生型植株为材料,利用双向电泳、Westernblot、酵母双杂交、qRT-PCR等技术手段揭示了VKOR蛋白在光合作用、信号转导及蛋白氧化还原等方面的调控作用。主要研究结果如下：(1)AtVKOR对植株生长发育起重要作用。本研究筛选得到两种AtVKOR基因缺失突变体株系的纯合体植株,突变体植株均表现出生长缓慢、叶片小和开花延迟等特征,说明AtVKOR基因对植株的生长发育非常重要。将AtVKOR基因转化野生型获得转基因植株,与突变体杂交获得补偿型植株。突变体补偿型植株恢复正常生长且检测发现AtVKOR基因表达水平与野生型接近,说明突变体的表型是由AtVKOR这一个基因表达缺失引起的。(2)AtVKOR定位于类囊体膜。GFP(绿色荧光蛋白)示踪方法证实AtVKOR定位于叶绿体中,本研究进一步提取完整的叶绿体、基质和类囊体,以叶绿体基质蛋白Rubisco活化酶和类囊体膜蛋白D1作为参照,通过Westernblot证实AtVKOR是类囊体膜蛋白,其功能区面向类囊体腔,这对于研究该蛋白的功能及交互蛋白奠定了基础。(3)蛋白质组学分析表明AtVKOR缺失影响众多蛋白的表达量。为探究AtVKOR的缺失对植株生长发育的影响,本研究首先对突变体和野生型植株的蛋白质组进行了分析比较,发现突变体中RuBP羧化酶亚基等11个蛋白表达量上调,而光系统Ⅱ(PSⅡ)组分及多种活性氧(ROS)清除酶等12个蛋白表达量明显下调。qRT-PCR进一步分析发现,PSⅡ组分PsbP11的基因转录水平降低了约50%,参与ROS清除的酶APX1、CAT2和DHAR1的基因转录水平降低了约20%。结果暗示AtVKOR可能影响PSII的功能及参与ROS的代谢调控。(4)AtVKOR缺失后严重影响植株的光合效率并导致PSII核心D1蛋白加速降解。由于AtVKOR影响PsbP1的表达,本研究检测了PSII活性,发现突变体的叶绿素荧光参数Fv/Fm和ΦDPSⅡ与野生型和补偿型植株相比均显著降低,Westernblot检测发现PSII核心D1蛋白含量显著减少,RT-PCR和Northernbolt证实编码D1蛋白的PsbA基因表达并不受抑制,推测AtVKOR缺失加速D1蛋白的降解。类囊体膜组分分析也发现突变体的PSII二聚体和超级复合体的含量明显减少,说明AtVKOR缺失以后PSII复合体的组装受到严重影响,导致活性下降。(5)AtVKOR参与胁迫条件下ROS的代谢及脱落酸(ABA)信号的转导。强光、盐、干旱和ABA处理后,突变体ROS的含量显著高于野生型和转基因植株的含量,说明AtVKOR参与胁迫条件下ROS的代谢,野生型和补偿型植株的AnnAt1蛋白具有ROS清除功能且AnnAt1基因受盐、干旱胁迫和ABA的诱导表达显著上调,胁迫处理后突变体AnnAt1基因的表达水平变化不明显,而ABA处理后AnnAt1基因表达显著升高。另外一个ABA响应标志基因RD29B的转录水平变化趋势与AnnAt1的一致,证实AtVKOR参与胁迫条件下ABA信号的转导。(6)AtVKOR互作蛋白的筛选鉴定。AtVKOR的拓扑学结构已经证实具有催化二硫键形成的结构域面向类囊体腔一侧,可能催化腔内蛋白质二硫键的形成。本研究选择22个可能形成二硫键的腔内蛋白作为AtVKOR的候选靶蛋白,克隆候选靶蛋白基因到AD载体,克隆AtVKOR基因到BD载体作为诱饵,通过酵母双杂交鉴定出8个蛋白与AtVKOR互作。将部分蛋白原核表达并纯化,体外实验证实AtVKOR能够与部分类囊体腔蛋白结合发生互作,推测AtVKOR能够调控部分类囊体腔蛋白的氧化还原状态。综上,通过对拟南芥VKOR蛋白功能的分析,为叶绿体氧化还原调控在植物生长发育及逆境胁迫响应中的调控机理的研究提供了新的理论依据。
【作者】卢瑛；
【导师】王晓云；
【作者基本信息】山东农业大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】AtVKOR；ABA信号转导；AnnAt1；ROS；PSⅡ组装；D1蛋白；巯基/二硫键；氧化还原调控；酵母双杂交分析；

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