膀胱癌顺铂耐药与其基因甲基化相关性研究

【摘要】目的：通过了解顺铂耐药膀胱癌细胞中DNA甲基化谱的改变，探索与发生顺铂耐药密切相关的基因的甲基化及其蛋白表达的变化，为阐明膀胱癌化疗耐药机制提供新的实验依据。方法：（1）顺铂耐药膀胱癌细胞株的建立：利用顺铂浓度梯度递增法(0.2-2.0mg/L)，在T24膀胱癌细胞中建立顺铂耐受的细胞株亚型（T24/DDP），并对细胞的各项生物学指标进行检测，包括顺铂敏感性、细胞形态学、细胞生长曲线及细胞周期等。（2）顺铂耐药膀胱癌细胞DNA甲基化谱分析与耐药相关甲基化基因的筛选：DNA甲基化芯片对T24及T24/DDP细胞基因组的DNA甲基化谱进行分析，并通过统计学方法，筛选高甲基化，及低甲基化修饰基因。利用realtime-PCR方法对筛选出的具有表达差异的甲基化修饰基因进行分析，并结合文献资料，最终采用MSP法，对筛选出的甲基化修饰基因进行进一步的验证分析。（3）通过5-氮杂-2-脱氧核苷去甲基化了解顺铂耐药膀胱癌细胞生物学的作用；并对细胞生物学指标进行检测。（4）采用5-氮杂-2-脱氧核苷去甲基化了解逆转顺铂耐药膀胱癌细胞的分子机制：利用realtime-PCR及westernblot方法，对T24/DDP及经5-氮杂-2-脱氧核苷去甲基化处理T24/DDP细胞中关键基因及其蛋白的表达进行分析。结果：（1）成功建立顺铂耐药的膀胱癌细胞（T24/DDP）：DDP敏感性实验表明，在20ug/ml浓度的DDP处理下，T24细胞死亡率接近100%，而同样浓度下顺铂耐受的细胞株亚型T24/DDP细胞的死亡率则是30%。细胞生长曲线表明，T24与T24/DDP细胞的倍增时间分别为72.5和90.2小时。细胞形态学观察表明，T24与T24/DDP细胞形态学无明显差异。细胞周期分析表明，T24/DDP细胞中G0/G1期细胞比例显著增加，G2/M期细胞下降。（2）顺铂耐药膀胱癌细胞DNA甲基化差异基因筛选：利用DNA甲基化谱芯片对T24及T24/DDP两个细胞系的基因组DNA甲基化谱进行分析，发现1120个甲基化差异位点；并筛选出40个高甲基化，18个低甲基化修饰基因。然后通过realtime-PCR方法对该58个差异甲基化修饰基因的表达进行了分析，发现其中30个基因的表达有统计学差异。结合文献资料，又筛选出和本研究相关基因20个，采用MSP法，对这些基因的甲基化修饰在细胞水平上又进行了验证分析，最终筛选出与甲基化谱芯片结果一致的15种基因，包括14种高甲基化和1种低甲基化修饰基因。（3）5-氮杂-2-脱氧核苷去甲基化对顺铂耐药膀胱癌细胞的生物学作用：经去甲基化处理后，之前发现的14种高甲基化修饰差异基因中的7种基因的高甲基化修饰被改变：ABCC6，CCNA1，HPP1，ITGA4，RASSF1A,RUNX3，TMS1。同时去甲基化处理后，T24/DDP细胞对于顺铂的敏感性显著提高、细胞凋亡比例增加、S期细胞比例显著增加。（4）5-氮杂-2-脱氧核苷去甲基化逆转顺铂耐药膀胱癌细胞的分子机制研究：利用realtime-PCR和westernblot方法的分析结果表明，上述7种基因（ABCC6，CCNA1，HPP1，ITGA4，RASSF1A,RUNX3，TMS1），经5-氮杂-2-脱氧核苷去甲基化处理后，其mRNA及蛋白的表达水平显著增加。结论：（1）顺铂浓度梯度递增法所建立的T24/DDP细胞株对顺铂具有很好的耐受性，可以作为体外模型用于顺铂耐药机制的研究。（2）膀胱癌细胞发生顺铂耐药时，细胞基因组存在广泛的DNA甲基化修饰改变。（3）5μM5-氮杂-2-脱氧核苷处理T24/DDP细胞，能使部分高甲基化修饰基因发生去甲基化，而提高T24/DDP细胞对于顺铂的敏感性。（4）ABCC6，CCNA1，HPP1，ITGA4，RASSF1A,RUNX3，TMS1等7种基因的甲基化修饰可能在介导顺铂耐受作用机制中发挥重要作用。
【作者】张青川；
【导师】单玉喜；
【作者基本信息】苏州大学，外科学，2013，博士
【关键词】膀胱癌；顺铂；耐药；甲基化；基因芯片；

【参考文献】
[1]李艳梅.金莲花质量标准规范化研究[D].河北师范大学,有机化学,2012,硕士.
[2]王波,张帆,黄福.还原态氧化石墨烯的制备及其对重金属离子的吸附性能[J].应用化学,2014,04:502-504.
[3]王雪缙.张爱玲与笔下人物的生存哲学及她的终极信仰[D].西南大学,中国现当代文学,2013,硕士.
[4]陆峰.实行外包是我国银行发展CRM的可行之路[J].华南金融电脑,2001,05:14-16.
[5]雷蕾.对外汉语教学中古典诗歌教学的教法探究[D].吉林大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[6]敖永红,邹钢,吴志,刘俊林.基于SQLServer数据库多媒体数据的管理[J].微型电脑应用.2002(01)
[7]田永奇.软海绵Halichondria sp与绿藻Pseudendoclonium akinetum的化学成分研究[D].上海海洋大学,食品科学与工程,2013,硕士.
[8]张成平,张顶立,韩凯航,王剑晨.深圳地铁富水软弱地层工程性质及开挖后沉降特征研究[J].现代隧道技术,2014,04:113-120.
[9]诸颖政.晚明士人知识趣味的多样化[D].复旦大学,专门史,2012,硕士.
[10]吴柯豫.竹笋深加工机理与工艺技术研究[D].中南林业科技大学,植物学,2014,硕士.
[11]李冠民.天津市自来水集团企业信息化发展规划与研究[D].天津大学,工业工程,2004,硕士.
[12]潘也唐.含铁碳基多孔复合材料的制备及其催化性能研究[D].哈尔滨工业大学,无机化学,2013,硕士.
[13]马婷婷.教育生态学视角下普通高中教育资源配置问题及对策研究[D].东北师范大学,教育经济与管理,2012,硕士.
[14]刘勇.半自动售票技术研究[D].南京理工大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[15]刘记霞.基于医院视角下医患关系研究[D].河北经贸大学,工商管理,2014,硕士.
[16]周明慧.子宫颈腺癌26例临床分析[D].大连医科大学,妇产科学,2012,硕士.
[17]王耀辉.清洁生产——现代工业的可持续发展战略[J].机电信息.1999(01)
[18]张洁.信用资本影响企业价值的实证研究[D].重庆工商大学,会计学,2012,硕士.
[19]赖国霞.理论研究应力与氮掺杂对石墨烯的稳定性以及带隙的影响[J].科技资讯,2015,15:89-90.
[20]张明君.能达电气公司物流管理系统研究[D].重庆大学,2004.
[21]白玉.克林顿新经济政策探析[D].西南大学,世界史,2013,硕士.
[22]柳娟娟.人口流动背景下兰州市民族团结教育研究[D].西北师范大学,思想政治教育,2013,硕士.
[23]荆幼阳.中小学爱国主义教育实效性研究[D].中南民族大学,思想政治教育,2013,硕士.
[24]隆英芬.商务英语词汇学习策略研究[D].广西师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[25]房亮.双馈风力发电机的故障穿越技术与仿真研究[D].中北大学,控制工程,2014,硕士.
[26]董新培.乌鳢线粒体DNA控制区结构分析及遗传多样性[D].河北大学,细胞生物学,2014,硕士.
[27]张燕.小学生意外伤害健康教育干预效果评价[D].安徽医科大学,流行病与卫生统计学,2004,硕士.
[28]窦天芳,张成昱,张蓓,邹志华.ResearcherID现状分析及应用启发[J].图书情报工作,2014,04:40-45.
[29]郭永莹.我国集体协商制度研究[D].上海社会科学院,民商法学,2012,硕士.
[30]潘星安.政府平台融资对政信集合信托产品的风险影响[D].上海交通大学,工商管理,2013,硕士.
[31]陈彭年,秦化淑,洪奕光,韩正之.离散时间非线性最小相位系统的动态输出反馈镇定[J].自动化学报,2002,05:681-689.
[32]张庆.基于CORBA的自适应负载均衡服务的设计与实现[D].西北工业大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[33]吉锡媛.不平等权势关系下缓和人际冲突的策略的语用研究[D].广东外语外贸大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[34]刘璐.稀土多酸对环氧化反应的催化性能的研究[D].北京化工大学,化学工程与技术,2013,硕士.
[35]万超.理论与实践的对照[D].华中师范大学,学科教学,2014,硕士.
[36]陈秋月.蒸汽驱模拟装置改造及注化学剂调驱实验研究[D].东北石油大学,油气田开发工程,2013,硕士.
[37]王秀燕.小学数学参与式课堂教学的实践研究[D].河北师范大学,教育管理,2014,硕士.
[38]高静,董鹏玉,樊伶颖,曹宝成.TiO_2/石墨烯复合材料的制备及其细胞相容性[J].材料保护,2014,S1:23-27.
[39]雍黎记者冯竞.重庆：推进4项改革创新体制机制[N].科技日报,2015-01-31003.
[40]周玲.“说长法”对非英语专业学生英语口语的影响[D].扬州大学,英语语言文学,2011,硕士.
[41]李建华.尿脱落细胞细胞角蛋白20在膀胱移行细胞癌的表达及临床意义[D].第四军医大学,外科学,2004,硕士.
[42]查瑞生.基于GIS的县域主体功能区划分研究[D].西南大学,地图学与地理信息系统,2014,硕士.
[43]杜玉敏.硕士研究生教育质量评估中的学生评价研究[D].山西财经大学,教育经济与管理,2014,硕士.
[44]周海荣.成本企画及其在我国的应用探析[D].中国海洋大学,会计学,2003,硕士.
[45]郑勇涛,刘玉树.一种基于支持向量机的空间数据分类方法[J].微机发展,2005,07:76-78.
[46]陈健.基于PCI的数据采集系统的研究与实现[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2004,硕士.
[47]张秀婷.通讯波段全光纤关联光子源的脉冲泵浦源实验研究[D].天津大学,光学工程,2013,硕士.
[48]李颖.肱骨髓腔形态的测量和自锁髓内钉的设计[D].第四军医大学,外科学,2004,硕士.
[49]高丽华.资源依托型旅游产品创新研究——以苏州古典园林为例[D].苏州大学,2003.
[50]马振.浅析利他惩罚在化解社会矛盾中的作用[D].中南民族大学,法律（专业学位）,2013,硕士.