番茄叶绿体DnaJ蛋白LeCDJ1功能分析

【摘要】温度胁迫是番茄在保护地栽培生产中的主要障碍因素之一。它破坏细胞内蛋白质的正确空间构象,诱导产生大量的活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS),引起植物光系统II(photosystemⅡ,PSII)的光抑制。为了生存,植物进化出了许多机制以适应环境,包括诱导产生热激蛋白(heatshockprotein,Hsp)。DnaJ蛋白是Hsp40家族的一员,是广泛存在于植物细胞内的一种分子伴侣。作为Hsp70的辅伴侣分子,它可以独自或协助Hsp70完成蛋白质折叠、解折叠和调节蛋白复合物解聚等功能,对于逆境条件下蛋白质或蛋白复合体的稳定的维持具有重要作用。因此,探讨温度胁迫下DnaJ蛋白的生理功能对于揭示番茄等喜温蔬菜的耐冷机制及分子基础,指导喜温蔬菜抗逆栽培和育种具有重要的理论意义和实践价值。本实验克隆了一个番茄叶绿体定位的DnaJ蛋白基因(LeCDJ1),并以转正义和反义LeCDJ1的番茄为材料,研究了过表达及抑制表达LeCDJ1对转基因番茄在温度胁迫下PSII的稳定性及ROS清除能力等方面的影响,主要结果如下：(1)根据NCBI查得该基因的全长mRNA序列(GenBank注册号：AK323422.1),通过DNAman软件设计特异引物,利用RT-PCR的方法获得LeCDJ1的全长cDNA.LeCDJl全长814bp,开放阅读框483bp,编码161个氨基酸。(2)拟南芥原生质体中瞬时表达p35S-LeCDJ1-GFP融合蛋白,并通过Confocal观察发现GFP激发的绿色荧光和叶绿素的红色自发荧光完全重合,说明LeCDJ1蛋白定位于叶绿体。(3)酵母双杂交结果显示LeCDJ1可以与叶绿体定位的cpHsp70互作。(4)成功构建了pET-LeCDJl原核表达载体,用IPTG诱导LeCDJl在大肠杆菌BL21中表达,将诱导表达的蛋白质纯化后免疫小鼠,制备抗体,测得效价为1：50000,用于下一步的Westernblot.(5)qRT-PCR和Northern杂交分析表明,LeCDJ1基因在叶绿素含量高的组织(叶片)中表达量较高。同时该基因的表达受4℃、38℃、42℃、45℃、NaCl、PEG、MV和H202的诱导,其表达水平随胁迫处理时间的延长而变化。此外,LeCDJ1的表达还受到ABA的诱导。(6)将LeCDJl的编码区连入pBI121载体,构建了LeCDJl的过表达和抑制表达载体。利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄,获得正、反义转基因番茄植株,并通过PCR、qRT-PCR以及Western杂交的方法检测具有卡那抗性的转基因植株,结果表明成功获得了LeCDJl过表达和抑制表达的转基因番茄植株。(7)正常生长条件下,野生型与正、反义转基因植株表型上无明显差别。但是,低温胁迫条件下,过表达株系较野生型能维持较好的生长表型,较低的细胞膜受伤害程度,较低的O2-和H2O2含量,说明过表达LeCDJ1基因提高了番茄植株的抗低温胁迫能力。(8)低温胁迫条件下,转正义番茄植株与野生型和反义植株相比,表现出较高的Fv/Fm和较低的qI,说明转正义基因番茄PSⅡ的光抑制程度较轻。Western杂交和BN-PAGE分析结果进一步表明,低温处理后转正义基因番茄的D1蛋白含量以及类囊体膜上的PSⅡ复合体的稳定性也较高。D1蛋白合成抑制剂硫酸链霉素(SM)处理的转正义基因番茄的Fv/Fm、D1蛋白含量及PSⅡ复合体的稳定性依然比SM未处理的野生型高,说明LeCDJ1对于PSⅡ的保护作用至少不仅仅依赖于D1蛋白的从头合成。(9)高温胁迫条件下,转正义基因番茄较野生型能维持较低的O2-和H2O2含量、细胞膜受伤害程度和PSⅡ的光抑制程度,较高的APX和SOD活性。qRT-PCR分析抗氧化相关酶基因的表达,结果显示APX和SOD酶活性的提高与其基因的表达水平无关。
【作者】孔凡英；
【导师】孟庆伟；
【作者基本信息】山东农业大学，植物学，2014，博士
【关键词】番茄；LeCDJ1；PSⅡ；ROS；低温；高温；

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