乙型肝炎病毒X蛋白诱发肝细胞恶性转化机制的定量蛋白组学研究

【摘要】原发性肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是世界范围内恶性肿瘤中发病率居第五、致死率居第三的恶性疾病。每年全世界约有700,000例新增患者，其中男性发病率远远高于女性,且主要集中于东南亚地区以及非洲撒哈拉沙漠以南区域，呈现显著的地域性分布。中国大陆地区HCC患者数量占全世界患者数量的50%，其中男性发病率为35.2/100,000，女性发病率为13.3/100,000。病因学统计显示54%的HCC患者与乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）感染关系密切。虽然HBV疫苗的强制接种使目前中国HBV病毒感染者数量由9.75%降到7.18%，但由于人口基数庞大以及已有感染者发生HCC的滞后效应等因素的影响，HBV患者的治疗和预防依然是中国社会亟待解决的公共卫生安全问题。HBV基因编码四种蛋白，包括表面抗原HBsAg、核心区蛋白（HBeAg和HBcAg）、病毒DNA聚合酶HBp以及HBx。其中HBx是一种多功能的病毒调节因子，具有促进肝细胞转化为肝细胞癌的功能。近年来通过酵母双杂交、染色质免疫共沉淀、表达谱芯片分析以及蛋白质免疫共沉淀等技术发现HBx主要参与调节病毒与宿主细胞基因的转录、信号转导途径和蛋白质降解水平等多个生物学过程，进一步证实了HBx基因功能的复杂性和多样性。尽管在HBx基因功能研究中取得较大成绩，但是在研究的策略、实验模型以及模型的疾病状态方面存在诸多不足。主要体现为研究策略局限于局部的信号或代谢通路，缺乏系统性、整体性的分析，或者仅有基因mRNA水平的系统评价，缺少蛋白质水平的系统分析；实验模型多以患者组织样本或体外培养的细胞系为主，忽视了细胞微环境和遗传异质性等要素对于HBx致病机制研究的干扰。此外，HBx引发的从肝脏炎症并发展至癌症的进程中的作用机制并没有得到清晰的阐释。本研究旨在利用高覆盖、高精度的定量蛋白质组学技术探索HBx诱发小鼠肝脏炎症向癌症转化的病理生理学机制。研究依托HBx转基因致肝癌小鼠模型，选择分别代表HBx诱发的肝脏炎症与癌症病理状态的12个月（12M）和24个月（24M）的组织作为实验材料，以HBx转基因小鼠的同窝正常小鼠作为实验对照，以避免遗传背景和外界环境对HBx基因功能研究的干扰。选用实验室制备的重稳定性同位素标记氨基酸完全标记的小鼠作为定量内标，实现高精度蛋白质组定量。同时，通过蛋白质免疫共沉淀技术结合蛋白质组学技术，筛选与HBx发生相互作用的关键分子。以“与HBx相互作用蛋白”为中心点结合定量蛋白组学数据，重构“HBx-结合蛋白-信号效应”的HBx网络调控图。本研究在国内首次发展了用于小鼠模型的SILAC整体标记方法。利用含有重稳定性同位素标记赖氨酸（[13C6]-Lysine）的SILAC鼠粮饲养C57BL/6小鼠，实现代谢过程中的小鼠蛋白质组高标记。对不同器官组织样品进行标记效率的LC-MS/MS定量分析，证明F2代小鼠的整体标记效率达到95%以上。其中用于HBx小鼠实验中的F2代SILAC小鼠肝脏标记效率达到96.34%±0.90%，这为高精度定量蛋白质组学研究创造了条件。在蛋白质-蛋白质相互作用研究中，我们共鉴定到162个与HBx相互作用的蛋白。GO分析显示这些蛋白质涉及细胞骨架重构、线粒体组份、脂代谢、转录调控、细胞周期调控和RNA可变剪接等诸多过程。其中47个已经被以前的研究证实，占鉴定的162个相互作用蛋白的近30%，显示了蛋白质组学在研究蛋白质-蛋白质相互作用中的可行性。剩余的115个蛋白质为首次鉴定的和HBx相互作用的蛋白质，体现了我们蛋白质组检测平台的灵敏度和高覆盖蛋白质组技术的优势。在这162个HBx相互作用蛋白中，最大的群体是细胞骨架相关蛋白。共有37个蛋白质属于这个类群，包括肌凝蛋白MYL6B、肌动蛋白相关蛋白ACTR3B、连环蛋白β-catenin、驱动蛋白KIF11和KIF5C、血管抑素结合蛋白AMOT、肌动蛋白结合蛋白SVIL等。这些蛋白可通过复杂的相互作用促进细胞增殖，影响细胞迁移、管状结构的形成以及伪足的数量等，并进而影响血管生成。第二大蛋白质类群是与线粒体功能活动关系密切的相互作用蛋白，共32个，包括谷氨酰胺环化酶γGGCT、脱氧尿苷三磷酸酶DUT、腺嘌呤磷酸核糖转移酶APRT、Ca2+的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族分子CAMK2D等。这些蛋白质参与核酸和氨基酸代谢、RNA可变剪接等生物学过程。特别值得关注的是HBx不仅可与β脂肪酸氧化进程中的脂肪酰辅酶A合成酶ACSF2和脂肪羟酰辅酶A脱氢酶家族成员HADH等2个限速酶发生相互作用，而且还与酯酶分子甾醇载体蛋白SCP2、胰腺三酰甘油脂肪酶PNLIP和脂钙蛋白酶LCN1发生相互作用，从而干扰肝细胞脂代谢过程。这可能是HBV介导肝脏脂肪化和炎症的主要原因。在HBx转基因小鼠的蛋白质组研究中，我们共鉴定了4744个蛋白质，其中从12MHBx、24MHBx组及其同窝小鼠中分别鉴定了3491、3464和3442、3298（FDR<1%）个蛋白质，四组样品中共同鉴定的蛋白质有2504个（FDR<1%）。在定量研究方面，12MHBx和12MWT组定量分析的蛋白质有2816个，定量数据的对数值整体呈现正态分布，其SD值为0.20；24MHBx和24MWT组定量分析的蛋白数目为2731个，定量数据整体分布的SD值为0.42。24MHBx组SD值与12MHBx组SD值相比，差异具有统计学意义（P<0.05），表明在HBx介导的从炎症向癌症发生的进程中，肝脏组织的异质性在逐渐增加。以2.0倍差异作为生物学差异蛋白的筛选标准，我们在12MHBx组样品中鉴定了22个差异表达蛋白，其中15个呈现上调趋势，7个呈现下调趋势；在24MHBx组发现97个差异表达蛋白，其中72个上调，25个下调。差异蛋白质的GO分析显示在12MHBx阶段肌肉组织发育等功能显著异常，这可能与肝脏星状细胞活化引发细胞外基质纤维化相关；24MHBx结果显示氧化还原、肌肉组织发育、转录活性、细胞骨架组成、糖代谢、脂代谢、小G蛋白信号途径等生物学进程显著富集。尤其是12M和24MHBx介导小鼠肝脏由炎症向癌症发展的过程中，我们分别鉴定了与CDC42信号途径相关的3个和15个蛋白质表达上调，这提示CDC42信号途径激活可能是HBx介导肝脏炎症向癌症发展的主要原因。在12MHBx炎症组织中，虽然没有发现线粒体功能紊乱的线索，但观察到4个与脂代谢关系密切相关的蛋白如ADFP、DHTKD1、AKR1C18和CES2表达变化。当HBx介导肝脏由炎症进入癌症阶段，18个线粒体功能相关蛋白如NDUFA5、LDHD、IVD和DHTKD1等表达变化显著。线粒体是细胞脂肪代谢的主要场所之一，研究结果暗示脂肪代谢紊乱和线粒体功能失调可能也是HBx引发肝脏炎症进展到癌症的主要原因。将HBx相互作用蛋白质组与定量蛋白质组学数据整合，我们发现两组数据在HBx转染累及的细胞骨架和线粒体功能方面具有很好的一致性。我们据此提出“HBx引发细胞骨架重塑和线粒体功能失调扰乱肝细胞脂代谢过程，诱发肝脏由炎症向癌症转化”的假设，并通过免疫组织化学和蛋白印迹实验等进行了验证，进一步说明了我们定量蛋白组学研究结论的正确性。在此基础上，我们从HBx诱发小鼠肝脏炎症和癌症阶段呈现相似差异的蛋白质中筛选获得了与细胞骨架和脂代谢关系密切的丝切蛋白（Cofilin-1，CFL1）和脂肪分化相关蛋白（Adiposedifferentiation-relatedprotein，ADFP）作为肝病发生和发展的候选生物标志物分子进行了深入研究。利用免疫组织化学分析临床HBV-HCC和非HBV-HCC肝癌组织样本中的CFL1和ADFP的表达水平，我们发现CFL1和ADFP在HBV-HCC肝癌组织中的表达水平明显高于非HBV-HCC，显示了CFL1和ADFP具有作为生物标志物所必需的保守性和组织特异性。按照肝癌早期预警与诊断标志物应具备特异性高、敏感、重现性好和患者依从性优等要素，我们又进一步分析了HBV、HBV-HCC和HCV等患者的血清样本中CFL1和ADFP的蛋白质丰度，发现在HBV以及HBV-HCC患者血清中ADFP的丰度显著升高，而CFL1在血清中未被检测到。因此，ADFP可作为HBV诱发肝细胞癌早期预警及诊断的潜在标志物。综上所述，本研究依托实验室的高覆盖和高精度定量蛋白组学研究技术平台，以HBx转基因鼠为基因功能研究模型和SILAC小鼠作为蛋白组学定量内标，深入系统地开展了HBx的功能蛋白质组学研究，揭示了HBx通过诱发细胞骨架重塑和干扰线粒体功能引起肝炎向肝癌发展的分子机制。在此基础上，通过对大量临床样本的研究进一步证实ADFP可能是HBV诱发的肝细胞癌的早期预警及诊断标志物，不仅丰富了HBx的生物学功能及其引发肝病发生和发展的分子机制，也为HBV相关疾病的防诊治研究提供了思路和靶标。
【作者】徐忠伟；
【导师】徐平；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】定量蛋白组学；肝细胞癌；相互作用蛋白；肝脏炎症；乙型肝炎病毒；蛋白质组学；线粒体功能；脂代谢；肝癌发生；免疫共沉淀；

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