SGEF增强EGFR蛋白稳定性的分子机制及生物学意义

【摘要】EGFR信号通路的异常激活与前列腺癌的恶性进展、高Gleason分级及雄激素非依赖进程密切相关。最新的研究发现，在前列腺肿瘤标本中，仅有8%的EGFR发生突变，但却有高达31%的标本中EGFR发生高表达，提示EGFR的高表达是前列腺癌中EGFR信号通路异常激活的主要原因。EGFR在肿瘤组织中高表达主要有两个原因，一是基因扩增，另一个是蛋白降解受阻。该项研究并没有发现组织水平EGFR高表达与EGFR基因扩增具有显著的相关性，提示EGFR蛋白分子的降解受阻可能是前列腺癌中EGFR异常表达的主要原因。但目前对于前列腺癌中EGFR蛋白稳定性调控的分子机制还不明确，因此发现新的EGFR蛋白稳定性的调节分子对于阐明前列腺癌恶性进展的分子机制具有重要意义。SGEF是我们前期发现的前列腺癌中的一种潜在的癌基因，临床研究表明SGEF随着前列腺癌的恶性进展表达水平逐渐升高，且我们发现SGEF能够促进前列腺癌细胞的增殖和存活能力，但我们对于SGEF在前列腺癌中发挥癌基因作用的具体分子机制还不清楚。我们的前期研究发现，敲低SGEF能够抑制AKT分子的磷酸化，而AKT是EGFR下游的重要分子，因此我们推测SGEF有可能通过对EGFR蛋白稳定性的调节进而调控EGFR/AKT信号通路。我们首先检测了SGEF是否影响前列腺癌细胞中EGFR蛋白表达水平，我们发现敲低SGEF降低了前列腺癌细胞C4-2B和DU145中EGFR的蛋白表达水平，提示我们SGEF确实能够调控前列腺癌细胞中EGFR蛋白表达水平。为了进一步确定SGEF调控EGFR蛋白表达水平的机制，我们检测了过表达SGEF对EGFR蛋白降解的影响，发现在293T细胞和COS7细胞中过表达SGEF能够明显EGFR蛋白的降解。随后我们在多种前列腺癌细胞中检测了敲低SGEF对EGFR蛋白降解的影响，我们发现在多种前列腺癌细胞中敲低SGEF均能明显促进EGFR蛋白的降解。这些结果说明SGEF能够通过增强EGFR蛋白稳定性来增强前列腺癌细胞中EGFR的蛋白表达水平。由于SGEF是RhoG特异性的鸟苷酸交换酶，我们随后检测了SGEF是否以鸟苷酸交换酶活性依赖的方式增强EGFR蛋白的稳定性。我们缺失鸟苷酸交换酶活性的SGEF依然能够抑制EGFR蛋白的降解，同时发现持续激活型的RhoG不能够回转敲低SGEF对EGFR蛋白降解的促进作用，这些结果说明SGEF是以鸟苷酸交换酶活性非依赖的方式增强EGFR蛋白的稳定性。EGFR在细胞中的降解受多重调控，EGFR与配体结合后，发生二聚化和自磷酸化，磷酸化的EGFR招募E3泛素酶Cbl促使EGFR发生泛素化。泛素化的EGFR在Eps15和epsin-1的介导下发生内吞进入细胞浆中。内吞的EGFR先进入早期内体，然后在ESCRT复合物介导下进入晚期内体，最后在溶酶体中发生降解。我们随后检测了SGEF是通过哪一环节参与EGFR蛋白的降解调节。我们发现过表达SGEF并不影响EGFR的泛素化、内吞和进入早期内体，而是抑制EGFR从早期内体进入晚期内体。随后我们在前列腺癌细胞中发现敲低SGEF不影响EGFR进入早期内体，而是促进了EGFR从早期内体进入晚期内体。这些结果说明了SGEF是通过抑制EGFR从早期内体进入晚期内体进而抑制EGFR蛋白降解的。EGFR的高表达通常与EGFR信号通路的异常激活密切相关，我们随后检测了SGEF是否能够调控EGFR信号通路。我们发现敲低SGEF明显抑制了EGF诱导的EGFR和下游蛋白AKT的磷酸化。由于EGFR/AKT信号通路在前列腺癌细胞迁移中发挥着重要作用，我们利用划痕实验检测了SGEF对前列腺癌细胞迁移的影响，结果发现敲低SGEF明显抑制了EGF诱导的细胞迁移。EGFR/ERK1/2信号通路在细胞多种生命活动中均发挥着重要作用。既然我们发现了SGEF能够增强EGFR蛋白的稳定性，我们随后检测了SGEF对EGFR/ERK1/2信号通路的影响。我们发现过表达SGEF能够显著增强EGF诱导的ERK1/2磷酸化，而敲低SGEF能够明显抑制EGF诱导的ERK1/2磷酸化，说明SGEF能够增强EGFR/ERK1/2信号通路。随后我们检测了SGEF是否以RhoG依赖的方式增强EGFR/ERK1/2信号通路，我们发现敲低RhoG的表达并不能抑制SGEF对EGFR/ERK1/2信号通路的增强作用，说明SGEF能够以RhoG非依赖的方式增强EGFR/ERK1/2信号通路。Grb2在EGF诱导的ERK1/2激活的过程中发挥着重要的作用。由于Grb2的两端含有SH3结构域，而SGEF的N端含有Pro结构域，而SH3结构域与Pro结构域之间存在着经典的相互作用，因此我们推测SGEF有可能通过与Grb2相互作用进而增强EGFR/ERK1/2信号通路。我们通过GST-pulldown实验和免疫共沉淀实验验证了两者之间的相互作用，随后确认了Grb2的SH3结构域与SGEF的Pro结构域介导了两者之间的相互作用。但当我们检测缺失与Grb2相互作用的SGEF突变体对EGFR/ERK1/2信号通路的影响时，我们出乎意料的发现与野生型SGEF相比，SGEF突变体不但没有减弱对EGFR/ERK1/2信号通路的增强作用，反而进一步增强了EGF诱导的ERK1/2磷酸化，这就提示我们Grb2可能通过与SGEF相互作用拮抗SGEF对EGFR/ERK1/2信号通路的增强作用。随后我们发现过表达Grb2确实能够抑制SGEF对EGFR/ERK1/2信号通路的增强作用，而敲低Grb2促进了SGEF对EGFR/ERK1/2信号通路的增强作用，并且发现Grb2拮抗SGEF对EGFR/ERK1/2信号通路的增强作用依赖与Grb2与SGEF之间的相互作用。总之，本研究发现了SGEF能够通过抑制EGFR从早期内体进入晚期内体从而增强EGFR蛋白稳定性。由于EGFR的高表达是前列腺癌细胞中EGFR信号通路异常激活的主要原因，SGEF对于EGFR蛋白稳定性的调控可能是SGEF促进前列腺癌恶性进展的原因之一。同时由于多种生长因子受体的降解方式与EGFR一致，SGEF有可能通过类似的方式抑制多种生长因子受体的降解，发挥其癌基因的功能。同时我们发现SGEF能够以RhoG非依赖的方式增强EGF诱导的ERK1/2激活，且Grb2能够通过与SGEF相互作用拮抗SGEF对EGFR/ERK1/2信号通路的增强作用。由于Grb2一直被认为在EGFR/ERK1/2信号通路中发挥正调控作用，本研究中发现了在SGEF过表达的情况下Grb2能够负调控EGFR/ERK1/2信号通路，揭示出Grb2在EGFR/ERK1/2信号通路调控中功能的复杂性。
【作者】王洪涛；
【导师】周建光；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，遗传学，2014，博士
【关键词】前列腺癌；EGFR；SGEF；Grb2；ERK1/2；

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