VEGF靶向抗体研制及其促肿瘤分子机制探讨

【摘要】血管内皮生长因子（VEGF）在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用。VEGF通过血管内皮细胞表面VEGFR2受体激活下游信号，可诱导内皮细胞的生长、迁移和管状形成，促进新生血管形成、提高血管通透性，满足肿瘤细胞对氧和营养的需求。阻断VEGF-VEGFR2信号通路抑制血管异常增生是肿瘤靶向治疗的重要策略。Avastin是FDA批准上市的靶向VEGF人源化单克隆抗体，广泛应用于转移性结肠癌、非小细胞肺癌等肿瘤的临床治疗。开发具有自主知识产权的新型靶向VEGF抗体具有重要的理论和实际意义。近期研究表明，VEGF参与肿瘤进程并不局限于通过促进血管生成和提高血管通透性。VEGF可以与肿瘤细胞表面的受体结合激活下游信号通路，直接参与肿瘤干细胞形成、肿瘤发生以及肿瘤迁移等进程。VEGF还可以通过调控miRNA参与炎性反应。然而，VEGF是否通过调节miRNA参与肿瘤进程鲜见报道。本研究借助抗体类分子设计平台，根据VEGF-Avastin相互作用复合物立体结构信息设计获得靶向VEGF新抗体MIL60，通过生物学实验评价其抑瘤活性；并进一步探讨VEGF通过调控miR21促进肿瘤迁移的分子机制。一、新型靶向VEGF抗体设计及其生物学功能评价借助分子模拟、动态对接方法从理论上探讨了MIL60与VEGF相互作用模式，MIL60结合VEGF的模式与Avastin相同。生物学实验结果表明，MIL60能够特异性、高亲和力地结合VEGF。MIL60与VEGF相互作用的亲和力与Avastin相近（为44.5pMvs42.7pM），两个抗体识别相同的抗原表位。体外实验结果显示，MIL60可以有效中和VEGF，阻断VEGF与HUVEC细胞表面VEGFR2的结合，抑制VEGFR2磷酸化及其下游P38/IKK/NF-κB和ERK信号通路；从而抑制HUVEC的增殖、迁移、成管等与新生血管生成密切相关的生物学功能。在小鼠荷瘤模型中，MIL60能显著抑制结肠癌和卵巢癌等肿瘤增殖；降低肿瘤组织中新生血管密度。抗体MIL60的这一系列生物学功能与Avastin具有良好的等效性。提示，新抗体MIL60可以通过抑制新生血管生成发挥显著的抑瘤活性。二、VEGF参与肿瘤进程分子机制探索将VEGF靶向治疗前后的肿瘤组织进行miRNA芯片比对分析，结果显示，靶向VEGF抗体治疗前后肿瘤组织中miRNA表达谱呈现显著变化。其中，原癌基因miR-21表达水平的明显下调。靶向VEGF抗体治疗的主要机制是中和VEGF，阻断其与受体的结合，因此我们假设VEGF可能参与miR-21表达调控。进一步的研究显示，HIF-1a诱导的肿瘤细胞自分泌VEGF以及外源性VEGF均能特异性地上调miR-21表达水平；靶向VEGF抗体可以逆转该效应，提示VEGF可以上调miR-21表达。VEGF通过细胞表面的特异性受体才能激活下游信号通路，特异性抗体阻断、siRNA干扰等实验结果提示，VEGF特异性地通过肿瘤细胞表面VEGFR1激活下游信号通路，促进NF-κB磷酸化并入核，上调miR-21的表达。VEGF通过调控miR-21可以促进肿瘤细胞HT-29迁移，而对细胞增殖没有显著的影响。借助Tarbase6.0数据库分析miR-21调控靶蛋白，利用DAVID进行聚类分析，共20种miR-21靶蛋白参与细胞迁移，进一步借助生物学进行验证，提示miR-21可能通过下调PTEN、APC、TGF-βRⅢ等抑制肿瘤细胞迁移蛋白的表达水平，进而促进HT-29肿瘤细胞迁移。本研究创新之处在于：获得的新抗体MIL60能特异性阻断VEGF-VEGFR2信号通路，具有良好的抑制新生血管生成功能和抑瘤活性，是肿瘤靶向治疗的候选新药。本研究还揭示了VEGF促进肿瘤进程的新机制。VEGF可以特异性地与肿瘤细胞表面的VEGFR1相互作用，激活VEGF-VEGFR1-NFκB信号通路，上调miR-21的表达；VEGF诱导上调的miR-21进一步下调抑制细胞迁移的靶基因促进肿瘤细胞的迁移。本研究还从另一个角度提示，靶向VEGF抗体不仅能通过阻断VEGF与血管内皮细胞表面VEGFR2结合，抑制肿瘤组织中新生血管的生成，发挥抗肿瘤活性；还可以通过阻断VEGF与肿瘤细胞表面VEGFR1作用，降低促癌基因miR21表达水平，进而抑制肿瘤转移。
【作者】杨静；
【导师】冯健男；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，免疫学，2014，博士
【关键词】VEGF；VEGFR2；靶向抗体MIL60；VEGFR1；miR-21；

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