粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白介素（IL）-1β在慢性肠炎恶性转化中的作用及机制研究

【摘要】背景：炎性肠病（InflammatoryBowelDiseases,IBD）,是一种常见的病因不明的慢性肠道炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎（UlcerativeColitis,UC）和克罗恩病（Crohn’sDiseases,CD）。UC多累及乙状结肠和直肠,病理变化局限于结肠黏膜及黏膜下层，表现为黏膜的破坏和溃疡的形成，临床症状多为腹泻、腹痛和黏液脓血便，其具有病程长、难治愈、易复发、症状难以控制等特点。近年研究发现，随着疾病的迁延不愈和炎症的加重，并发结直肠癌的风险逐步增加：UC患者10年后累计癌变率为2%，20年上升至为8%，而30年以上者则高达18%。在另一项对UC人群和正常人群进行对照回顾性研究发现，UC人群的结直肠癌的发病率是正常人群的2-3倍。尽管UC相关结直肠癌（Colitis-associatedcolorectalcancer,CAC）只占整个人群中结直肠癌的1%-2%，但它被认为是UC的严重并发症，据统计，约15%的UC患者死于癌症。目前，人们对于慢性不可控性肠炎如何促进肠道肿瘤的发生知之甚少。鉴于肠道是人体比较特殊的器官，定居着数以亿计的共生菌，这些共生菌对肠道肿瘤产生的影响逐渐被人们所重视。有研究表明，肠道上皮细胞屏障的破坏可以导致肠道共生菌的移位，透过肠道粘膜屏障，进而引起持续的炎症反应。慢性炎性反应造成大量的炎性细胞浸润，继而释放炎性细胞因子以及活性介质。肿瘤微环境中浸润的炎性细胞以及他们所营造的炎性微环境，可以引起肠上皮细胞的突变，并且为突变细胞增殖、存活、逃避免疫监视进而顺利完成原位肿瘤的生成提供便利。目的：探究促炎细胞因子GM-CSF和IL-1β在肠炎向肠癌恶性转化过程中的作用及其机制。方法及结果：我们利用氧化偶氮甲烷（azoxymethane,AOM）和葡聚糖硫酸钠（dextransulfatesodium,DSS）的联合诱导作用建立了肠炎相关结直肠癌的动物模型，这个模型可以很好的模拟UC病人的肠炎恶性转化过程，因此在1990年获得国际公认，成为广泛使用的研究CAC的动物模型。利用该模型我们深入研究了肠炎恶性转化过程中的免疫学机制，具体结果包括：1）在肠炎相关结直肠癌诱导过程中，根据疾病的发展阶段设置了不同的检测时间点，以便对肿瘤产生过程持续监控。我们发现在炎症期，以多种炎性细胞因子大量持续性释放（如GM-CSF、IL-1β、IL-6、VEGF）为标志。流式和免疫组化结果显示，肠道组织中开始浸润大量的中性粒细胞。在肿瘤发生期，以肠道出现明显可见的肿瘤为标志，此时浸润的中性粒细胞数量显著增加。因此研究浸润的中性粒细胞在肠炎恶性转化过程中的作用，成为我们的研究重点之一。2）用抗体对建模小鼠体内中性粒细胞进行清除，可以有效减少肿瘤产生;浸润的中性粒细胞输入移植瘤模型小鼠体内可以促进移植瘤的生长，这些结果都表明肠粘膜中浸润的中性粒细胞在肠炎恶性转化过程中发挥重要的促进作用。3）细胞因子表达谱检测发现，浸润的中性粒细胞产生大量的IL-1β，并且这种分泌效果具有部位特异性：相比于肿瘤部位浸润的中性粒细胞，CAC小鼠脾脏中的中性粒细胞IL-1β的分泌量很低，说明中性粒细胞表达IL-1β受微环境的调控。对IL-1β与CAC的关系研究显示，用IL-1受体拮抗剂阻断IL-1信号能够明显减少肿瘤的产生，这表明IL-1β是CAC发生的重要推动因素。4）关于IL-1β如何促进CAC的产生，我们发现，无论是体内还是体外实验均显示，IL-1β是诱导肠粘膜定居的单核吞噬细胞分泌过量IL-6的重要因子，这导致IL-6持续性的刺激肠上皮细胞中STAT3/NF-KB信号通路的活化，致使上皮细胞的失控性增殖，最终导致肿瘤的发生。用抗体中和IL-6能够有效的抑制CAC的产生。这就解释了IL-1β促进CAC产生的作用机理。通过以上的实验，我们揭示了一条新的慢性炎症促进肿瘤产生的作用轴，其以浸润的中性粒细胞分泌大量的IL-1β为核心事件，以细胞因子、免疫细胞共同参与为典型特征。另外我们也发现了一条免疫细胞非依赖的途径，这条通路以肠上皮细胞释放大量的GM-CSF为核心事件，具体结果如下：1）我们发现在炎症期和肿瘤产生期GM-CSF和VEGF在肠道中都持续高表达，进一步研究发现，二者主要是由肠上皮细胞分泌的。2）在小鼠结肠癌上皮细胞系CT-26和人结肠癌上皮细胞系HCT116上，GM-CSF均能诱导VEGF的表达。3）对涉及的信号通路研究，我们发现GM-CSF通过ERK1/2信号通路促进VEGF的表达，在体外用U0126对ERK1/2信号通路进行阻断，可以逆转GM-CSF对VEGF的表达的促进作用。4）在体内，用GM-CSF抗体对建模小鼠进行治疗，可以明显减少肿瘤的产生，抑制肠上皮细胞的ERK1/2信号通路，进而降低VEGF的表达，减少其VEGF受体的磷酸化水平，减少血管生成。此外，我们用VEGF抗体对建模小鼠进行治疗，发现可以明显减少血管生成，降低肿瘤生长必要的营养供应，进而抑制肿瘤产生。5）transwell实验结果显示，GMCSF能够通过诱导VEGF的释放进而促进肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。两条通路促进肠炎的恶性转化都存在更上游的问题，那就是什么原因触发了中性粒细胞的聚集并释放大量IL-1β以及诱导肠上皮细胞表达过量的GM-CSF？我们发现肠道内共生菌来源的LPS起到了关键作用，表明有害共生菌的移位在促肠炎/癌的恶性转化过程中起到了关键的作用。结论：肠道内有害的共生菌来源的LPS，可以刺激中性粒细胞分泌大量的IL-1β并促进上皮细胞分泌过量的GM-CSF，而这两个因子又可以分别通过促进下游因子IL-6以及VEGF的释放，在肠道内造成局部持续的高炎性微环境。炎性微环境为上皮细胞发生恶性转变、增殖、存活提供了条件，进而促进了肠道肿瘤的产生。
【作者】王一；
【导师】黎燕；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，免疫学，2014，博士
【关键词】炎症；肠炎相关结直肠癌；中性粒细胞；IL-1β；GM-CSF；

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