胆碱和阿司匹林协同抗炎作用及其药理学机制的研究

【摘要】关节炎、脓毒症、溃疡性结肠炎、动脉粥样硬化等一系列慢性进展性炎性疾病严重威胁人类健康。随着世界人口老龄化等问题的凸显，此类顽固性疾病的发病率也逐年升高，形势非常严峻，这已经成为非常令人关注的公共卫生问题之一。由于炎症反应涉及众多细胞因子和炎症介质的参与，目前针对此类疾病的治疗仍然是一个非常棘手的问题。非甾体类抗炎药（non-steroidalanti-inflammatorydrugs,NSAIDs）由于具有确切的镇痛抗炎作用，一直是各国推荐用于治疗关节炎的一线用药。但它们仅能改善炎症症状，并不能延缓疾病的进展，而且严重的胃肠道副作用限制了其临床应用。更为不幸的是，目前所有的抗炎药物用于治疗脓毒症这种失控性全身炎症反应的效果均被证明是无效的。因此，临床上可用的抗炎药物还远远不能满足治疗顽固性炎性疾病的需求，寻找新的抗炎靶点，研发更加安全有效的抗炎技术途径具有重要的价值。已经公认，激活α7烟碱样乙酰胆碱受体（α7受体）是治疗一系列难治性炎症疾病的重要策略。因为采用药理学途径激活α7受体可以显著抑制免疫细胞/内皮细胞合成和释放肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素、和高迁移率族蛋白1（HMGB1）等促炎细胞因子。在“靶向α7受体抗炎通路”这一研究领域内，胆碱是其中一个非常有发展前景的候选药物。因为胆碱是天然的α7受体选择性激动剂。同时，胆碱是机体必需的营养物质之一，是细胞膜卵磷脂和鞘磷脂的重要组成部分，是体内合成乙酰胆碱的前体物质和重要的甲基来源，口服安全无毒。有研究报道胆碱在不同的炎性疼痛模型上具有镇痛作用；在实验性脓毒症模型上也证实其具有保护作用；此作用与其激活α7受体有关。然而，胆碱对非感染性急性炎症是否具有抗炎性肿胀作用还不清楚；胆碱对于脓毒症的防治效果尚缺乏系统的研究。以临床上抗炎疗效确切的药物为基础，采用药物联用的方案，是开发新的抗炎技术途径的现实手段之一。阿司匹林是经典的NSAIDs。虽然阿司匹林大剂量使用会导致胃肠道副作用，但小剂量的阿司匹林却一直广泛用于防治伴有炎症和血液高凝状态的心血管疾病病人，而且业已证明其长期服用的有效性和安全性。值得关注的是，近年来的研究表明阿司匹林在抗炎方面比其他NSAIDs可能具有更多的治疗学优势。一方面，阿司匹林可以通过环氧合酶依赖和非依赖的分子途径发挥抗炎作用，表现在：（1）促进抗炎物质Aspirin-triggeredlipoxins（ATLs）的释放，增加了巨噬细胞的吞噬功能；（2）对各种免疫细胞均具有免疫调节作用，有利于治疗具有自身免疫反应特点的疾病等。另一方面，高选择性环氧合酶-2抑制剂的抗炎效果非但并不优于阿司匹林，而且有增加致死性心血管事件的风险。因此，阿司匹林在NSAIDs中仍占有重要地位。寻找一种具有不同作用机制的抗炎药物与阿司匹林联用将有可能达到增强其抗炎疗效，降低其使用剂量，从而降低剂量相关副作用的目的。由于胆碱可以通过激活α7受体抑制多种促炎细胞因子的释放，而阿司匹林也具有多条抗炎分子途径，理论上二者联用能够发挥更好的抗炎作用。有趣的是，本实验室前期研究表明，在不同的炎性疼痛模型上，胆碱能增强低剂量的阿司匹林的镇痛效应。因此，我们推测胆碱与低剂量阿司匹林具有协同抗炎作用，这可能是一个更加安全有效的抗炎途径。围绕这一工作假设，本论文第一章在角叉菜胶诱导的小鼠足趾肿胀模型上，以肿胀度为指标，评价了胆碱在急性非感染性局部炎症反应模型上的抗炎作用，并采用等辐射分析法研究了胆碱和阿司匹林联用的交互作用类型及其与α7受体的关系。本论文第二章在LPS诱导的小鼠脓毒症模型（全身失控性炎症反应模型）上，以生存时间和存活率为指标，系统研究了胆碱对全身炎症反应/脓毒症防治作用的最佳疗效；研究了胆碱与阿司匹林联用对脓毒症小鼠的防治效果及其与α7受体的关系；并探讨了二者联用对细胞因子和炎症介质释放的影响。主要研究结果如下：1.胆碱以及胆碱和阿司匹林联用抑制λ-角叉菜胶所致足趾炎性肿胀的药理学特征小鼠足趾底部注射1%λ-角叉菜胶后1,2,3,4,5,和6h，足趾肿胀度（%，mean±S.E.M）分别为12.7±1.3%,17.5±1.5%,22.1±2.1%,19.8±2.0%,17.2±1.8%,和16.0±2.2%。角叉菜胶注射后1~3h为急性炎性肿胀的发展期，4~6h为缓慢消退期，其中角叉菜胶注射后3h小鼠足趾肿胀达峰值。因此，选择角叉菜胶注射后1~3h为主要观测时间，并以3h这一时间点的肿胀度来计算药物作用的ED50值。阿司匹林11.25~200mg/kg腹腔注射预防1h可以剂量依赖性抑制足趾肿胀的程度。在角叉菜胶注射后3h，以模型组的平均肿胀度为100%，则阿司匹林11.25，22.5，45，100，和200mg/kg给药后的相对肿胀率分别为：94.6%，93.8%，72.0%，54.8%，和43.7%；ED50为136.73mg/kg（95%可信区间：87.41~213.87）。胆碱12.5~80mg/kg腹腔注射预防3h也可以剂量依赖性抑制小鼠足趾炎性肿胀程度。在角叉菜胶注射后3h，以模型组的平均肿胀度为100%，则胆碱12.5，25，50，和80mg/kg给药后的相对肿胀率分别为：91.1%，73.9%，70.5%，和66.9%；ED50为＞200.31mg/kg（95%可信区间：75.07~534.48）。单独给予胆碱12.5mg/kg和阿司匹林11.25mg/kg均无显著的抗肿胀作用，但两者联用时可以显著抑制足趾肿胀的程度，提示两者可能具有协同作用。在两药联用时的量-效关系研究中，我们根据等辐射分析法的原则，在维持两药这一固定剂量比例的条件下，采用剂量分别倍增/倍减的方式，设计了如下5个剂量组，即胆碱3.125mg/kg+阿司匹林2.8mg/kg、胆碱6.25mg/kg+阿司匹林5.625mg/kg、胆碱12.5mg/kg+阿司匹林11.25mg/kg、胆碱25mg/kg+阿司匹林22.5mg/kg、和胆碱50mg/kg+阿司匹林45mg/kg。结果表明，两药联用可以剂量依赖性抑制足趾肿胀的程度。以模型组的平均肿胀度为100%，联合给药各剂量组在角叉菜胶注射后3h小鼠的足趾相对肿胀度分别为83.2%、71.5%、59.7%、46.3%、和34.7%，据此计算得到两药联用时胆碱和阿司匹林的ED50分别为21.31mg/kg（19.73~23.04）和19.19mg/kg（17.76~20.73）。采用CalcuSyn2.0软件分析得出胆碱和阿司匹林联用的量-效曲线较分别单用时显著左移，提示两药联用既可以降低使用剂量，又可以提高抗炎效应。胆碱和阿司匹林联用时，在ED50，ED75，和ED90处的联合用药指数（Combinationindex，CI）值分别为0.25,0.32,和0.44。由于CI值<0.9为协同效应，<0.5为强协同效应，因此判断两药联用具有很强的协同抗炎效应。选择性α7受体拮抗剂MLA5mg/kg腹腔注射预防给药并不影响λ-角叉菜胶所致的足趾肿胀，但可以完全拮抗50mg/kg的胆碱对足趾肿胀的抑制作用。MLA2mg/kg可以拮抗胆碱12.5mg/kg和阿司匹林11.25mg/kg联用时对足趾肿胀的协同抑制作用。这表明单独给予胆碱抑制炎性肿胀的机制主要由激活α7受体介导；同时α7受体的激活参与了胆碱和阿司匹林的协同抗炎效应。2.胆碱以及胆碱和阿司匹林联用对抗LPS诱导的脓毒症的药理学特征50mg/kg的LPS静脉注射能成功建立失控性全身炎症反应（重度脓毒症）小鼠模型，动物在24小时内死亡率接近100%。单次预防给予胆碱10~50mg/kg对脓毒症小鼠生存时间和死亡率均无显著影响；胆碱60，70，和80mg/kg给药后可显著延长小鼠的中位生存期，存活率分别为30%，20%，和20%；其中以胆碱60mg/kg预防给药效果最佳。单次预防给予阿司匹林10和20mg/kg对脓毒症小鼠的生存曲线并无明显影响；预防给予阿司匹林40和60mg/kg后，脓毒症小鼠的中位生存期显著延长；阿司匹林10~60mg/kg预防给药后，模型动物的存活率分别为0%，10%，10%，10%；提示阿司匹林仅能减轻炎症反应，延缓死亡，但在提高脓毒症小鼠的存活率方面效果甚微。当阿司匹林的剂量高达100mg/kg时，其保护作用则完全消失，与文献报道一致。单用阿司匹林20mg/kg和单用胆碱40mg/kg对脓毒症小鼠均无显著影响，但两者联用却可以显著提高存活率（60%），利用Cox比例风险回归模型进行统计分析表明，二者存在显著的交互作用，提示两药预防联用时具有协同增强效应。采用正交设计的方法得到胆碱治疗脓毒症的最佳方案为40mg/kg间隔2h给药3次，但存活率也仅能提高到30%。而阿司匹林7.5~100mg/kg单用治疗的结果跟预防给药的结果类似。虽然胆碱最佳治疗方案和阿司匹林联合用药治疗脓毒症小鼠时并未发现协同作用，但在存活率方面，两药联用均高于单用，提示两药联用治疗脓毒症时有叠加作用。预防给予2mg/kgMLA本身并不影响模型小鼠的生存时间和存活率，但可以完全阻断60mg/kg胆碱对模型小鼠的保护作用，说明胆碱对脓毒症小鼠的治疗作用是通过激活α7受体介导的。2mg/kgMLA可以拮抗胆碱40mg/kg和阿司匹林20mg/kg联用的抗脓毒症效果，证明α7受体的激活参与了两药的协同保护作用。文献报道，无论是角叉菜胶还是LPS所致的炎症反应，在病理生理机制上均归咎于促炎细胞因子和炎症介质的大量释放。因此，我们研究了胆碱40mg/kg和阿司匹林20mg/kg单用或联用对LPS所致全身炎症反应小鼠血清细胞因子和炎症介质的影响。胆碱40mg/kg可以显著抑制LPS诱导的血中TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1、TXA2、PGI2、LTB4、和PGE2的病理性增高，但不影响IFN-γ和抗炎细胞因子IL-10的含量。而阿司匹林20mg/kg可以显著抑制IL-1β、IL-6、IL-10、TXA2、PGI2、LTB4、和PGE2的病理性增高，但不影响IFN-γ、TNF-α和HMGB1的含量。值得注意的是，两者联用时可以显著抑制TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、HMGB1、TXA2、PGI2、LTB4、和PGE2的病理性增高。两药联用较分别单用可以更有效地抑制IFN-γ、IL-1β、IL-6、HMGB1和PGE2的释放，表明胆碱和阿司匹林联用时能更好地抑制LPS所致促炎细胞因子和炎症介质的释放，更有效地控制机体的过度炎症反应。在离体培养的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞上，我们进一步探讨了如下两个问题：（1）阿司匹林是否增强胆碱对细胞因子TNF-α的抑制作用；（2）胆碱是否增强阿司匹林对花生四烯酸代谢的抑制作用。LPS（100ng/ml）刺激培养的RAW264.7细胞可致上清液中TNF-α的含量显著升高，胆碱（1~50mmol/L）可以剂量依赖性抑制TNF-α的释放，与文献报道一致；但100μmol/L的阿司匹林与50mmol/L的胆碱联用时却并不增强胆碱对TNF-α的抑制作用，提示两药联用的机制可能不是通过抑制TNF-α这一分子途径。LPS（1μg/ml）刺激培养的RAW264.7细胞可导致上清液中TXA2和PGI2的显著升高，阿司匹林（0.1~30μmol/L）可以剂量依赖性抑制TXA2和PGI2的释放；但胆碱（0.1~10mmol/L）并不影响TXA2和PGI2的含量；而且1mmol/L胆碱和阿司匹林联用并不影响阿司匹林对TXA2和PGI2释放的抑制作用。这提示胆碱并不直接抑制环氧合酶的活性，也不增强阿司匹林对环氧合酶活性的抑制作用。由于阿司匹林的抗血小板作用源于其对TXA2的抑制作用而阿司匹林的胃肠道副作用源于其对PGI2的抑制作用，而胆碱本身并不直接影响TXA2和PGI2的代谢，也不影响阿司匹林对TXA2和PGI2的抑制作用，提示两药联用的情况下，胆碱在提高阿司匹林的抗炎效果和降低使用剂量的同时，既不会增加阿司匹林所致的胃肠道副作用也不会增加出血倾向，表明胆碱和低剂量阿司匹林联用是更为安全有效的抗炎技术途径。综上所述，本研究得出如下结论：1.胆碱通过激活α7受体对局部和全身炎症反应发挥显著的抗炎作用。2.胆碱和低剂量阿司匹林联用具有协同抗炎作用，α7受体参与了二者的协同效应。3.胆碱和阿司匹林单独用于防治脓毒症效果有限，但二者预防联用具有协同增强效应，这与其能更有效地控制促炎细胞因子和炎症介质的释放密切有关。上述结果为临床上采用胆碱和低剂量阿司匹林联合用药的方案治疗炎性疾病提供了新的实验证据。
【作者】潘志远；
【导师】汪海；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，药理学，2014，博士
【关键词】胆碱；阿司匹林；炎症；脓毒症；λ-角叉菜胶；脂多糖；协同作用；细胞因子；α7受体；环氧合酶；

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