芥子气暴露后动物体内生物标志物-DNA加合物的检测及代谢研究

【摘要】芥子气，英文全称sulfurmustard（以下简称SM，美军代号HD），化学式为C4H8Cl2S，是双功能烷基化试剂，也是糜烂性化学战剂中最为重要的一种。芥子气制备过程简单，毒性大且持续时间较长，在战争中被数次使用，至今仍然威胁着世界和平和人民生命安全，有着“毒剂之王”之称。然而，芥子气的化学性质决定了其毒性具有广泛性，目前国际上关于其针对性解毒药物的研究进展缓慢，临床救治也多将其视作烧伤处理。因此，深入研究芥子气的毒理作用机制、筛选和开发其对抗特效治疗药物和临床医学干预方案具有重要现实意义，而这些亟需建立可靠的芥子气溯源性检测和毒理学评价方法。长期以来，国内外学者对芥子气毒理作用机制的研究不断深入，并提出了一系列理论。虽然目前仍未得出确切结论，但是各国学者普遍认同芥子气对DNA分子的烷基化损伤是其毒理作用的始发机制以及细胞毒性与生物毒性的物质基础。因此DNA烷基化损伤及修复过程中产生的内源性与外源性标志物可视为芥子气暴露后生物体损伤及恢复情况的有效评价指标。论文采用新兴的分析毒理学相关方法，通过检测芥子气与DNA的烷基化加合物（以下简称SM-DNA加合物）在体内的时效与量效变化趋势，实现对DNA的受损及修复过程的实时监控，从而定量阐述芥子气细胞毒性的物质基础与其毒性之间的相关性。现有文献报道最主要的SM-DNA加合物有以下四种：N7-（2-羟乙基硫代乙基）鸟嘌呤（N7-HETEG），双[2-(N7-鸟嘌呤)]乙硫醚（Bis-G），O6-（2-羟乙基硫代乙基）鸟嘌呤（O6-HETEG），N3（-2-羟乙基硫代乙基）腺嘌呤（N3-HETEA）。这四种SM-DNA加合物的特点各不相同，如N7-HETEG的丰度最高，N3-HETEA是腺嘌呤上唯一烷基化产物，而根据碱基配对原则，Bis-G与O6-HETEG的反应位点可直接破坏DNA双链结构等。因此同时分析这四类加合物就可以全面监测DNA分子的烷基化程度，获得芥子气暴露后DNA的损伤及修复情况，进而为评价救治方案提供可靠技术方法。论文首先建立了同时检测生物体内不同功能组织以及尿液中四种SM-DNA加合物的同位素稀释超高效液相色谱串级质谱（ID-UPLC-MS/MS）分析方法；其次，建立合理的芥子气皮肤染毒的实验动物模型，取其组织器官和尿液；最后，利用建立的分析方法监测SM-DNA加合物在生物体内不同脏器的时效、量效分布，以便全面了解芥子气在生物体内从局部到整体的分布与代谢规律。论文共分六章。第一章为前言，简要介绍了芥子气的相关理化性质，主要阐述其在体内的代谢途径和毒理机制的研究现状，重点介绍芥子气对DNA分子的损伤机理及其后续影响以及SM-DNA加合物的各种检测手段，提出研究目标和研究内容。第二章重点建立了不同脏器中四种SM-DNA加合物的ID-UPLC-MS/MS同时分析测定方法。由于组织中SM-DNA连接在DNA分子上，为结合态加合物，导致样品前处理过程相对复杂。经过一系列的优化过程，该分析方法采用“酶解蛋白—酚氯仿抽提—乙醇沉淀”法提取DNA分子，回收率较高；甲酸加热法水解碱基，利用ID-UPLC-MS/MS进行分析。方法回收率为83-118%，检测限为0.02-0.1ng/mL，定量限为0.05-0.2ng/mL。本章对组织匀浆、DNA提取到碱基水解等全过程进行详细、系统的优化，建立了高效、稳定的检测方法，为下一章各脏器中DNA损伤的研究提供技术支持。第三章建立了不同剂量下SD大鼠芥子气皮肤染毒的动物模型，对心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胰脏、肾脏、全脑等主要组织中SM-DNA加合物进行检测，并对其中变化最显著的组织进行了系统的时效、量效关系研究，全面的考察了不同暴露剂量的条件下，芥子气对不同功能的脏器组织中DNA分子的损伤情况及其自身修复的过程。实验结果表明SM-DNA加合物与染毒剂量和时间之间存在良好的量效、时效相关性；第一次系统证实了体内各脏器组织中Bis-G是丰度比例占第二位的DNA加合物（N7-HETEG，62.5-92.0%；Bis-G，7.9-37.0%；N3-HETEA，0.1-2.0%；O6-HETEG<0.1%；），揭示芥子气对DNA的损伤在前期研究中被严重低估；染毒剂量增加时，肺脏所受的损伤更为严重；肝脏可能并不是芥子气损伤的主要器官；发现脂类含量高或被脂肪包裹的组织中SM-DNA加合物含量相对较高，提示我们芥子气可能存在体内“脂肪蓄积”的问题；芥子气可以迅速通过血脑屏障，脑中脂类含量高，更易吸收并储存亲脂性的芥子气原型分子，导致单位DNA形成加合物比例高。第四章单独考察了芥子气对大鼠骨髓组织的损伤。骨髓组织是免疫细胞的产生地，实验将骨髓细胞按功能进行分型，分别观察了芥子气中毒后不同功能骨髓细胞的应答反应，有助于从细胞层面上了解芥子气对免疫系统的影响，并试图以此结果部分解释生物机体的中毒症状。研究结果表明：通过对骨髓细胞中SM-DNA加合物进行检测，发现骨髓中Bis-G不仅丰度高，而且随剂量增加其丰度比例甚至超过50%，成为最主要的DNA加合物，提示芥子气对骨髓中DNA更严重的损伤；芥子气染毒后，大鼠骨髓中单核细胞呈现先剧烈增殖后快速抑制的趋势，其计数变化幅度明显，而粒细胞等多核细胞则缓慢增殖，同时免疫细胞的变化趋势与动物的中毒体征状况具有高度的相关性；相同细胞计数下，单位单核或多核细胞中DNA加合物的含量近似，表明芥子气对单核或多核细胞中DNA的损伤是等同或没有偏好；而单位数量单核细胞中DNA加合物含量未呈现随时间变化的趋势，表明骨髓单核细胞中SM-DNA加合物含量的升高原因主要是由于细胞数量增加，再次证明芥子气烷烃化作用的本质。第五章选取体内代谢的最终载体—尿液作为检测样本，从整体轮廓层面分析SM-DNA的形成-修复-消失全过程，即观察DNA损伤及修复的全身变化过程，与组织中结果相互补充、相互验证。本部分开发了固相萃取新方法，用于尿液中四种SM-DNA加合物的同时提取。优化ID-UPLC-MS/MS方法，回收率达到87-116%，检测限为2-5pg/mL，定量限为5-10pg/mL，实现了对加合物的高灵敏检测。建立了芥子气皮肤染毒的动物模型，并对尿液中SM-DNA加合物进行分析检测。结果显示了良好的时效、量效关系曲线，并且获得了尿液中四种SM-DNA加合物的真实比例关系。从宏观上监测DNA损伤的全身代谢轮廓，与组织中结果进行比较，发现二者在时效关系以及加合物含量关系方面整体趋势相同，可以实现良好的相互验证。由于尿液检测无痛、无损，而且对于SM-DNA的检测可以一定程度的反映机体DNA损伤情况，可作为芥子气溯源分析以及损伤效应监测的理想检测对象。第六章是本论文建立方法的实际应用。我们得到了四名意外接触芥子气患者的尿液，将已建立的固相萃取-ID-UPLC-MS/MS方法应用于其尿液中四种SM-DNA加合物的同时定量检测。检测结果表明尿液中四种SM-DNA均可检出，不仅更进一步确证芥子气染毒，而且发现加合物的含量与患者的暴露程度和临床中毒症状相互吻合。上述结论证明SM-DNA加合物可以作为理想的芥子气溯源性生物标志物。
【作者】张雅姣；
【导师】谢剑炜；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，药物分析学，2014，博士
【关键词】芥子气；DNA加合物；代谢；高效液相色谱-串联质谱联用技术；

【参考文献】
[1]张威.建筑垃圾路用再生填料的加工与施工工艺研究[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2014,硕士.
[2]江文波.一球悬铃木种源内家系生长遗传变异及遗传多样性[D].南京林业大学,林木遗传育种,2004,硕士.
[3]王晓坡.新型吸收式制冷系统研究[D].河北工业大学,热能工程,2004,硕士.
[4]王冰,陈学东,王国平.大型低温LNG储罐设计与建造技术的新进展[J].天然气工业,2010,05:108-112+149.
[5]弓常青,赵恺,周晶.内蒙古工业大学民族预科生教育管理对策研究[J].内蒙古工业大学学报(社会科学版),2014,01:1-5.
[6]牛璐.刑事人身检查制度的比较法考察[D].南京师范大学,诉讼法学,2012,硕士.
[7]刘阳荭.幼儿书籍装帧设计研究[D].东北师范大学,设计艺术学,2012,硕士.
[8]湖南大学物理与微电子科学学院教授文双春.做科学,要睡美人还是要甜妞?[N].北京科技报,2015-06-22052.
[9]程全.替莫唑胺通过调控miR-223/PAX6抑制胶质瘤细胞增殖的研究[D].中南大学,临床医学,2014,博士.
[10]常秦,田建国.从双语心理词汇结构论述词汇学习策略[J].外语界,2012,02:74-80.
[11]郝亚南.基于语义的数据格式转换[D].河北大学,计算机应用技术,2003,硕士.
[12]孟凡立.社会养老服务体系中的政府责任[D].华中科技大学,法律,2013,硕士.
[13]王毅.数据挖掘技术在信用卡信用风险评分模型中的研究[D].东北财经大学,2005.
[14]张乐陶.基于多核DSP的外辐射源雷达相参积累算法设计及实现[D].北京理工大学,信息与通信工程,2014,硕士.
[15]孙茂艳,谢康林.基于客户关系属性的市场营销数据挖掘[J].计算机工程与应用,2005,18:215-218.
[16]单平.云南本土美术资源对云南绝版木刻版画创作的思考与拓展[D].云南艺术学院,木刻版画,2014,硕士.
[17]杨小川.我国结社自由立法的完善[D].内蒙古大学,宪法学与行政法学,2014,硕士.
[18]王晓玲.武当山世界遗产地资源管理研究[D].中国地质大学（北京）,地理学,2013,硕士.
[19]李健.供应链协调方法对于制造企业服务化水平的影响研究[D].哈尔滨工业大学,企业管理,2013,硕士.
[20]胡友谊.C公司培育家庭伦理导向的企业价值观研究[D].西南交通大学,工商管理,2012,硕士.
[21]杜杉.普罗科菲耶夫钢琴套曲《罗密欧与朱丽叶》之研究[D].山东师范大学,音乐学,2013,硕士.
[22]徐发仪.带湿度修正的煤气流量计量系统设计[J].冶金自动化,1989,03:48-50.
[23]沈宇超,邵国安.应急通信体系的探讨[J].电信网技术.2007(11)
[24]张璐伟.小学生课堂教学参与行为研究[D].河北大学,教育学原理,2014,硕士.
[25]李来.不同营养支持对肝硬化门静脉高压大鼠肠粘膜屏障功能的影响[D].青岛大学,普通外科学,2004,硕士.
[26]梅晓丽.文化创意企业知识型员工内在激励与创新行为关系研究[D].浙江理工大学,企业管理,2014,硕士.
[27]章文灿.我国饮料三片罐现状及改善途径[J].中国食品工业.1996(09)
[28]李广文.面向夹具CAD的知识挖掘技术的研究与应用[D].南京航空航天大学,航空宇航制造工程,2004,硕士.
[29]阮智漩.乐陶公益旅游企业的发展困境与对策研究[D].华侨大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[30]李响,谭南林,李国正,张驰.基于Zernike矩的人眼定位与状态识别[J].电子测量与仪器学报,2015,03:390-398.
[31]胡萍.营业税改增值税试点政策改善研究[D].华中师范大学,公共管理,2013,硕士.
[32]尤敬.基于位置的车载自组织网络通信路由协议研究[D].南京理工大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[33]常远.辽宁经济开放度对经济增长关系的实证分析[D].辽宁大学,国际贸易学,2012,硕士.
[34]航辉.鞍钢半连轧精轧过程自动化[J].冶金自动化,1995,04:9-13.
[35]张本贺.适用于含能化合物的反应器设计策略及其应用研究[D].浙江大学,化学工程,2014,硕士.
[36]赵一帆.X/CT影像中病变区域检测方法研究[D].西安电子科技大学,电路与系统,2012,硕士.
[37]李广瑞.调距桨系统半物理仿真研究[D].中国舰船研究院,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[38]万嫩.轿车混合动力用Hy-Vo齿形链系统设计分析及其噪声特性试验研究[D].吉林大学,机械工程,2014,硕士.
[39]蒋文.功率型LED散热性能研究[D].东北大学,工程热物理,2011,硕士.
[40]朱焕彬.杭州市区城市综合体的空间特征及影响效应研究[D].浙江大学,城市规划与设计,2012,硕士.
[41]张馨文.EPON技术在大连电信本地网中的应用研究[D].大连理工大学,电子与通信工程（专业学位）,2012,硕士.
[42]蒋小琦.财险理赔服务问题及策略研究[D].华侨大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[43]陈曦.江西省种稻大户不同类型农业技术需求分析[D].江西农业大学,农村区域发展,2012,硕士.
[44]余咪咪.基于生态理念的华山风景名胜区土地利用规划研究[D].西安建筑科技大学,城市规划,2004,硕士.
[45]吴娟.军用信息自动分类的研究与实现[D].南京理工大学,2004.
[46]本报记者张梦然.下一轮技术革命的序曲[N].科技日报,2010-09-05002.
[47]李炜.MT公司的自主品牌策略在欧洲市场应用的研究[D].华东理工大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[48]高士龙.工业多段分节提升门设计[D].吉林大学,机械工程,2014,硕士.
[49]蒋琪纯.闽南文化在高校德育的运用研究[D].华侨大学,思想政治教育,2013,硕士.
[50]肖观称.骨桥蛋白基因多态性与特发性草酸钙结石的相关性研究[D].南昌大学,外科学,2014,硕士.