基于扎伊尔埃博拉病毒包膜蛋白的新抗原片段筛选及rVSV载体疫苗的构建

【摘要】埃博拉病毒（Ebolavirus，EBOV）是烈性传染病埃博拉出血热（EHF）的病原体，属于A类生物战剂，有可能用于生物战及生物恐怖袭击。感染Ebola病毒后，相关疾病进展速度非常快，很难及时产生有效的保护性免疫反应，迄今为止，没有有效的疫苗及药物可用于埃博拉病毒感染的预防及临床治疗。目前，基于rAD5载体与rVSV载体且表达埃博拉病毒包膜蛋白（Glycoprotein，GP）的疫苗在非人灵长动物模型（NHP）中获得了良好的保护活性。rAD5（recombinantAdenovirus5）载体疫苗的主要问题是预存免疫，导致该疫苗较高的免疫剂量与较长的免疫周期。而rVSV(recombinantvesicularstomatitisvirus)载体疫苗则不存在预存免疫问题，能够快速诱导保护性的免疫反应并具有一定的病毒感染后治疗作用，而且在采取不同亚型病毒疫苗联合免疫时能够在NHP模型中对多个亚型病毒的感染产生有效的保护作用。然而，通过单价疫苗联合免疫策略进行多价疫苗的研究时，需要制备各个单价疫苗并对其免疫活性进行评价，制备成本较高且较为繁琐。而rVSV载体的插入基因上限为4.5kb，限制了基于单个载体构建表达多个亚型病毒GP蛋白的多价疫苗的可行性。据文献报道，来自于口蹄疫病毒的2A序列（FMDV-2A）在应用于蛋白共表达时，融合蛋白能够自动裂解为蛋白单体，因此我们利用该序列作为多价疫苗各抗原成分的连接序列。鉴于rVSV载体疫苗在对抗多亚型病毒感染及感染后保护作用的优势，本论文开展多价VSV疫苗研究。根据扎伊尔型埃博拉病毒包膜蛋白的抗原表位分布以及结构功能，综合抗原表位分析结果，设计了三个小片段抗原（GP1ΔM，MLD，L），利用pVAX1重组质粒免疫BALB/c小鼠，通过各抗原片段的体液免疫反应水平确定了优选抗原片段L（GP蛋白的aa393-556序列）。利用GP、L重组蛋白免疫小鼠，进一步确认抗原片段L的免疫原性，然后鉴定其抗原决定区。由于来自于口蹄疫病毒的2A序列（FMDV-2A）与蛋白共表达时可自动裂解为蛋白单体，我们应用反向遗传操作技术构建基于FMDV-2A自裂解序列与rVSVΔG载体且同时表达苏丹型埃博拉病毒包膜蛋白与抗原片段L的二价疫苗。主要研究结果如下：1.小片段抗原L具有高免疫原性，产生的抗体具有中和活性（1）位于Zaire-GP连接区域（aa393-556）的片段L能够诱导强烈的体液免疫反应与有效的细胞免疫反应我们选取了毒力最强的扎伊尔型埃博拉病毒包膜蛋白GP作为抗原筛选工作的基础，根据GP蛋白的抗原表位分布以及结构功能，设计了3个小片段抗原（GP1ΔM，MLD，L），构建pVAX1重组质粒并免疫BALB/c小鼠。免疫血清中的抗体水平结果表明，经3次免疫后，pVAX1-L免疫组血清抗体水平与pVAX1-GP免疫组相当，明显高于pVAX1-GP1ΔM免疫组与pVAX1-MLD免疫组，而且pVAX1-L免疫组血清中IgG2a/IgG1的水平与pVAX1-GP免疫血清一致，说明抗原片段L具有与GP相当的诱导体液免疫反应的能力，且优于片段GP1ΔM与MLD。GP及片段L重组蛋白免疫小鼠3次（10、24、38天）的结果表明，蛋白L各次免疫的血清抗体水平均与蛋白GP一致，进一步证明L片段诱导的体液免疫反应水平与GP相当。在细胞免疫反应水平方面，蛋白L免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖水平以及IL-2、IFN-γ分泌水平均明显高于生理盐水对照组，但低于蛋白GP免疫组，说明L片段能够诱导一定程度的细胞免疫反应。（2）L片段能有效诱导中和抗体的分泌利用假病毒模型测定GP、L片段免疫血清中的中和抗体水平。结果表明，L片段免疫血清与GP免疫血清对假病毒感染的抑制率之间没有显著性差异，说明二者免疫血清中的中和抗体水平基本一致，进一步证明了L片段具有不弱于GP的免疫原性。（3）L片段的主要抗原决定区位于包括furin位点与内部融合环的区域（GP蛋白的aa479-556）根据L片段不同区域的结构与功能，将其进一步划分为3个小片段LA（aa393-479），LM（aa436-519），LB（aa480-556），构建pVAX1重组质粒并免疫BALB/c小鼠后测定血清中的抗体水平。结果表明，经3次免疫后，LM、LB片段免疫血清中的抗体水平与L相比没有显著性差异，而LA片段免疫血清抗体水平则明显低于L免疫组。此外，LM、LB免疫血清对假病毒感染的抑制率与L免疫血清基本一致，即LM、LB能够有效诱导中和抗体的分泌，而LA则不能有效抑制假病毒的感染，其抑制率与空载体免疫血清基本一致。上述结果表明，L片段的主要抗原决定区包括除LA外的其他区域，即包括furin位点与内部融合环的序列（GP蛋白的aa479-556）。2.基于FMDV-2A自裂解序列与rVSV载体的二价疫苗rVSVΔG-SGP-2A-L可有效诱导针对Zaire-GP与Sudan-GP的交叉免疫反应军事医学科学院博士学位论文中文摘要为验证基于FMDV-2A自裂解序列与rVSV载体构建重组二价疫苗的可行性，我们进行了表达Sudan-GP与L两种抗原组分的rVSV载体重组二价疫苗rVSVΔG-SGP-2A-L的构建与包装。首先利用FMDV-2A自裂解序列构建Sudan-GP与该抗原片段的融合基因，克隆接入pVSVΔG载体中构建二价疫苗载体，通过反向遗传操作技术进行重组疫苗rVSVΔG-SGP-2A-L的包装，同时也完成了对照单价疫苗rVSVΔG-ZGP与rVSVΔG-SGP的包装。将获得的重组疫苗感染BHK21细胞，裂解细胞后进行westernblot分析以鉴定各抗原成分的表达效率。结果表明，重组疫苗感染BHK21细胞后能够诱导明显的CPE效应，并且能有效表达各抗原成分，其中rVSVΔG-SGP-2A-L表达的融合抗原SGP-2A-L能够有效裂解为单独的抗原Sudan-GP与L，并能够有效诱导针对Zaire-GP与Sudan-GP的交叉免疫反应，其IgG抗体水平及中和抗体水平与rVSVΔG-ZGP+rVSVΔG-SGP联合疫苗相当，提示利用FMDV-2A序列及抗原片段L能够构建有效的rVSV载体多价疫苗。综上所述，抗原片段L具有与Zaire-GP相当的免疫原性，能够有效诱导中和抗体的分泌，位于furin位点及内部融合环的序列是L片段的主要抗原决定区，基于rVSVΔG载体与FMDV-2A序列构建的二价疫苗能够高效表达两种单独的抗原成分，且能够诱导针对Zaire-GP与Sudan-GP的交叉免疫反应。抗原片段L能够替代GP蛋白构建基于rVSV载体的单价疫苗或构建基于FMDV-2A序列与rVSVΔG载体的多价疫苗。
【作者】王于；
【导师】戴秋云；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，微生物与生化药学，2014，博士
【关键词】疱疹口炎病毒载体；埃博拉病毒包膜蛋白；抗原片段；免疫原性；中和抗体；多价疫苗；

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