H7N9亚型流感病原生态学调查与流感病毒通用型人源化抗体的初步探索

【摘要】2013年2月19日，在我国首次发生H7N9亚型流感病毒感染人事件，并呈不断散发态势发展。在2014年1至2月，有110余人感染H7N9，26人死亡，家禽特别是活禽市场中的鸡、鸭等是主要传染来源。野鸟特别是候鸟（水禽类）是流感病毒的天然存储库得到公认，家禽中的H7N9亚型流感病毒，分析认为是由于饲养禽中的其它亚型流感病毒与野鸟中携带的流感病毒基因重组而成。但由于候鸟迁徙路线多，范围广，地理条件复杂，监测人员少等原因，使得对候鸟流感病毒病原生态学调查处在初级阶段，有的地方还是监测盲区。开展流感病毒病原生态学调查，对完善流感病毒的监测数据，了解流感病毒分布及流感病毒制剂的研发具有重要意义。同时，针对流感病毒急需研制一种新的治疗制剂。抗体是有效的紧急预防治疗制剂，但流感病毒基因易发生突变重组，单一抗体不能应对新的亚型流感病毒，研究一种通用型流感病毒治疗制剂是一个需要解决的技术问题。本研究开展了2项实验，H7N9亚型流感病毒病原生态学调查和通用型人源化抗体的初步探索。1．H7N9亚型流感病毒病原生态学调查研究。收集全国5省（江苏、安徽、江西、湖南、吉林）16个地区野鸟与部分家禽新鲜粪便及组织等样品2081份，进行病毒分离和亚型鉴定，并通过系统进化树分析分离的H7N9亚型流感病毒与之前发现的H7N9的进化关系。同时进行了驯养绿头鸭的人工感染实验，检验H7N9亚型流感病毒是否能够在绿头鸭中复制。实验内容：（1）病毒分离。在我国5个省市16个地区进行候鸟（以水禽为主）和部分家禽样本采集，用9日龄鸡胚分离H7N9亚型流感病毒。（2）病毒亚型检测。用RT-PCR分型引物和血凝活性实验方法进行检测，对鉴定为H7N9亚型的流感病毒进行基因测序，并构建系统进化树。（3）H7N9亚型流感病毒受体检测。用唾液酸受体（人样流感病毒受体SAα2-6Gal受体，禽样流感病毒SAα2-3Gal受体）糖链包被ELISA聚苯乙烯反应板，用蔗糖梯度法浓缩流感病毒，加到包被物中，再用鸡抗H7N9亚型流感病毒作为一抗，HRP标记的羊抗鸡二抗显色，观察显色结果，应用酶标仪选择吸光度值为492时读值。（4）H7N9亚型流感病毒人工感染驯养的绿头鸭实验。用A/Shanghai/2/2013H7N9亚型流感病毒株，经鼻腔感染绿头鸭，通过病毒滴定判定复制情况。2.流感病毒通用型人源化抗体的初步探索。筛选能与流感病毒HA根茎部保守区特异结合的抗体序列，应用计算机软件分析抗体的结构功能及与HA结合功能区氨基酸特点，进行合成抗流病毒抗体的轻、重链可变区基因，通过转化、酶切、连接等分子生物学方法，将轻、重链可变区基因与含人抗体Fc片段的杆状病毒表达载体PAC-κ-CH3连接，经鉴定正确后转染至昆虫细胞(sf9细胞)，无血清培养后进行鉴定。实验内容、方法：（1）通过文献检索、蛋白质序列数据库（Swissprot）、蛋白质结构数据库（PBD）等获得抗流感抗体的序列信息，经计算机分析软件InsightⅡ对抗体结构分析，经过分子模拟、分子对接等方法，对抗体的轻、重链可变区基因结构等分析，用昆虫细胞偏嗜密码子优化氨基酸序列，合成抗流感病毒抗体轻、重链可变区基因。（2）重组表达载体的构建。将合成氨基酸序列中的轻、重链可变区基因酶切鉴定，把轻链可变区基因与杆状病毒表达载体PAC-κ-CH3连接，构建PAC-κ-L-CH3,经鉴定正确，酶切合成的重链可变区基因，与PAC-κ-L-CH3连接,构建PAC-κ-L-H-CH3重组表达载体，鉴定正确后，同杆状病毒DNA共转染至昆虫细胞(sf9)中，27℃，经无血清培养后，收集上清。（3）人源化抗体通用性的鉴定。应用本室保存的各亚型流感病毒株，灭活后进行血凝抑制、ELISA实验，检测制备的抗体对流感病毒的通用性，通过荧光抗体实验，检测抗体在细胞中的表达情况。通过以上实验获得以下结果：1．采集的野鸟样粪便样品中，未分离到H7N9亚型流感病毒，但在血清及鸟蛋的卵黄中检测到H7亚型阳性抗体；在吉林省长春市净月家禽粪便样品中，应用RT-PCR和SPF鸡胚检测和分离到2株H7N9流感病毒；2．对分离的H7N9亚型流感病毒测HA和NA序列全长，应用NCBI网站上BLAST进行核苷酸比对，应用MAGE6.0软件构建系统进化树，分离到的H7N9亚型流感病毒HA与广州2013年鸡的样本中分离的病毒株核苷酸序列在同一进化分枝，同源性为98.6%；NA与2013年福建环境样本中分离的H7N9核苷酸序列在同一进化分枝，同源性为99.2%；经受体检测，分离到的H7N9亚型流感病毒可识别SAα2-3Gal和SAα2-6Gal唾液酸受体，与SAα2-3Gal结合能力强于SAα2-6Gal唾液酸受体；3．人工感染绿头鸭实验中，同组及对照组绿头鸭均未见有发病症状，应用鸡胚对样本进行病毒分离，未检测到病毒复制，说明应用的流感病毒株（A/Shanghai/2/2013，H7N9）不能在绿头鸭体内复制和传播。4．通过文献检索、蛋白质序列数据库（Swissprot）、蛋白质结构数据库（PBD）等获得抗流感抗体的序列信息，经计算机分析软件InsightⅡ对抗体结构分析，经过分子模拟、分子对接等方法，筛选出6组抗流感病毒抗体轻、重链可变区基因，编号分别为A66，H40，H98，F10，JAN，D80。通过分子对接方法搭建了F10与HA作用的复合物结构；5．转染重组表达载体转染至sf9细胞获得杆状病毒，并可传代培养；用血凝抑制实验、ELISA实验获得3株具有通用性的抗流感病毒抗体，分别为编号H40，H98和A66，2株对2种流感病毒抑制作用，其中1株(F10)对H7N9有血凝抑制作用；1株（D80）对流感病毒没有血凝抑制作用；荧光抗体检测传代细胞上清中有阳性表达。通过以上结果得出以下结论：1．野鸟样品中未检测到H7N9亚型流感病毒，野鸟传播引发人间病例的可能性小，但是，在鹭鸟卵黄和血清中检测到H亚型抗体，说明野鸟传播H7亚型病毒的可能性存在；在家禽样品中获得2株H7N9.亚型流感病毒；用A/Shanghai/2/2013(H7N9)毒株在绿头鸭进行人工感染实验，结果说明该病毒在绿头鸭体内不能复制；2．获得了3个对流感病毒具有抑制作用的人源化抗体，但不能抑制所有流感病毒亚型，说明在应用抗体治疗流感病毒时，多种单克隆抗体混合使用会取得抑制多种亚型流感病毒的效果。本研究结果表明H7N9亚型流感病毒病原生态学调查结果，野鸟中传播此次感染人的H7N9亚型病毒可能性较小，在人工感染绿头鸭H7N9亚型流感病毒的实验中得到证实。但在血清及鸟蛋的卵黄中检测到H7亚型流感病毒阳性抗体，这也说明野鸟中传播H7亚型的病毒可能性存在。在进行H7N9亚型流感病原学调查前，本实验进行流感病毒人源化通用抗体的初步探索，后期补充了H7N9病毒的实验。在实验中挑选出能够对3种流感病毒具有抑制作用的抗体，但是不能抑制流感病毒的所有亚型，说明在应用抗体治疗疾病时，多种单抗混合使用是一个可行性的方案，本研究同时为研制人源化抗体提供了一个技术参考和思路。
【作者】王铁成；
【导师】夏咸柱；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，预防兽医学，2014，博士
【关键词】H7N9亚型流感病毒；野鸟；唾液酸受体；人源化抗体；

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