MiR-526a参与RLRs介导先天性免疫应答的分子机制研究

【摘要】肠道病毒71型（Enterovirus，EV71）包含单股正链RNA基因组，属于小RNA病毒科（picornavirusfamily）肠道病毒属成员,其感染婴幼儿后能引起手足口病（hand-foot-mouthdisease，HFMD）。EV71基因组长约7.5Kb(kilobase,Kb)，仅由一个开放阅读框构成，编码一个多聚蛋白前体,这个多聚蛋白前体能裂解成四个结构蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4），七个非结构蛋白（2A、2B、2C和3A、3B、3C和3D）。虽然有研究表明IFN-I（typeIinterferon，IFN-I）能保护细胞抵抗EV71的感染，然而EV71并不诱导IFN-I的产生。最近研究发现EV71能够通过阻断RIG-I、干扰素调节因子7（interferonregulatedfactor7，IRF7）以及I型干扰素受体（IFN-Ireceptor，IFNAR）的表达来抑制干扰素诱导基因（Interferon-stimulatedgene,ISG）的激活。宿主通过模式识别受体（patternrecognitionreceptor，PRR）和病原微生物的病原相关分子模式（pathogen-associatedmolecularpattern，PAMP）的相互作用来识别病毒和入侵微生物。PRR包括了膜受体和胞质受体。膜受体为Toll样受体（Toll-likereceptors,TLRs），而胞质受体包括NOD样受体（NOD-likereceptor，NLRs）以及RLR样受体（（RIG-I-likereceptor，RLRs）。RLR样受体包括RIG-I（retinoidacid-induciblegeneI,RIG-I）和MDA-5(melanomadifferentiation-associatedgene5,MDA-5)。RIG-I和MDA-5都包含CARD结构域(caspaserecruitmentdomains)，结合非帽化的RNA后与同样含有CARD结构域的线粒体抗病毒蛋白（mitochondrialantiviralsignaling，MAVS）结合，导致MAVS和IKK激酶（IBkinase）结合，然后以此为平台募集下游不同的信号分子组成不同的调控复合物，最终激活核因子B（nuclearfactor-kappaB，NF-B）和干扰素调节因子3（interferonregulatedfactor，IRF3），进而起始-干扰素（interferon-β，IFN-）的表达及IFN介导的抗病毒免疫。RIG-I信号通路受泛素化、去泛素化、磷酸化以及去磷酸化的调控。前期报道肿瘤抑制因子圆柱瘤基因（Cylindromatosis，CYLD）可以通过调控RIG-I的泛素化参与宿主的先天性免疫应答信号传导途径。在树突状细胞（Dendriticcells,DC）中缺失CYLD会诱导持续泛素化RIG-I，并增强TANK结合激酶1（TANK-bindingkinase1，TBK1）和IκB激酶（TheIκBkinase，IKK）的活性。除了RIG-I,CYLD同样能去除核因子KappaB基本调节因子（Nuclearfactor-KappaBessentialmodulator，NEMO）、IKK、肿瘤坏死因子受体相关因子2（TNFreceptor-associatedfactor2，TRAF2）以及B细胞淋巴瘤蛋白3（B-cellCLL/lymphoma3，Bcl-3）的K63位泛素化来负调控NF-B和c-JunN末端激酶（JunN-terminalkinase，JNK）信号通路。这些发现确定了CYLD成为抗病毒先天性免疫应答的关键调控分子。MicroRNA（miRNA）是一类高度保守的非编码小RNA分子，平均长度为22nt（nucleotide，nt）。miRNA通过与靶基因的3’UTR（untranslationalregion，UTR）结合来抑制基因表达。miRNA参与调节许多生命进程，发挥重要的作用。近来报道了在单核细胞核巨噬细胞中miRNA参与调控先天性免疫应答，如miR-146a靶向白介素1受体相关激酶1（IL-1Rassociatedkinase1，IRAK1）和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNFreceptorassociatedfactor6，TRAF6）来负调控RIG-I样受体（RIG-I-likereceptor，RLR）信号通路。然而到目前为止尚未发现关于EV71通过miRNA调控RIG-I信号通路的报道。本研究发现：1.miR-526a的表达受RNA病毒诱导激活的IRF3/7转录因子的调控：利用荧光定量PCR(quantitativepolymerasechainreactin，q-PCR)的方法，发现RNA病毒感染可以显著促进细胞内miR-526a的表达；通过RNA干涉手段，发现IRF3、7敲低细胞中水泡性口炎病毒（vesicularstomatitisvirus，VSV）诱导的miR-526a上调被显著抑制，以上结果提示我们miR-526a的表达受RNA病毒诱导激活的IRF3/7转录因子的调控。2.miR-526a促进RIG-I信号通路的激活：通过合成miR-526a模拟物以及抑制剂，利用IFN-、NF-B以及IRF3报告基因活性检测方法，发现miR-526a模拟物可以显著增强RIG-I信号通路的激活，这种激活活性可以被miR-526a抑制剂阻断；利用q-PCR以及AlphaLISA技术，发现miR-526a能够促进病毒诱导的IFN-的转录和分泌；利用q-PCR方法，发现miR-526a的过表达能够激活IFN-的下游诱导基因ISG56、ISG54、白介素-8（interleukin-8，IL-8）以及趋化因子配体-2（Chemokine(C-X-Cmotif)ligand2，CXCL-2）的表达，以上结果显示miR-526a是参与调控RIG-I信号通路的正调控因子。3.miR-526a抑制VSV和NDV病毒的复制：用免疫印迹检测发现miR-526a模拟物能够抑制VSV病毒感染后VSV-G蛋白的表达；以新城疫病毒NDV-GFP（NewcastleDiseaseVirus，NDV）病毒感染细胞为模型，利用荧光显微镜以及流式细胞术检测方法发现miR-526a模拟物可以显著抑制NDV病毒在细胞内的复制，以上结果提示我们miR-526a可以抑制RNA病毒复制。4.miR-526a通过靶向CYLD激活RIG-I信号通路：通过生物信息学软件TargetScan等预测，发现CYLD是miR-526a潜在的靶点。检测带有不同位置的CYLD3’UTR荧光素酶报告基因的活性发现CYLD存在miR-526a作用位点；利用q-PCR以及免疫印迹方法，发现miR-526a模拟物能够下调CYLD的转录水平以及蛋白水平。利用细胞泛素化实验，发现miR-526a模拟物可以增强病毒诱导的RIG-IK63位泛素化水平，而miR-526a抑制剂可以抑制病毒诱导的RIG-I的泛素化；利用免疫印迹实验，发现miR-526a模拟物可以增强病毒诱导的IKK/、IB及IRF3的磷酸化，以上实验说明miR-526a通过靶向CYLD增强RIG-I的K63位泛素化修饰，进而激活RIG-I信号通路。5.EV71病毒利用3C蛋白酶靶向miR-526a抑制RIG-I信号通路的激活：利用q-PCR以及免疫印迹技术，发现EV71病毒感染后下调miR-526a的表达、IRF7的激活以及IFN-的产生，以上表型均由EV71的3C蛋白酶介导；通过免疫印迹技术，发现miR-526a模拟物及CYLD的小干扰RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)能够抑制EV71病毒的复制以及EV71VP1蛋白的表达，以上结果说明EV71通过靶向miR-526a阻断RIG-I信号通路的激活。综上所述，我们发现病毒感染巨噬细胞后能显著上调miR-526a，并依赖IRF3/7的激活。而miR-526a通过靶向CYLD，去除RIG-I的K63位泛素化正调控VSV介导的IRF3和NF-B的激活。进一步发现了EV71的3C蛋白酶能够抑制miR-526a的表达，过表达miR-526a能够抑制EV71的复制。因此本研究第一次发现了miR-526a是RIG-I信号通路的一个正调控因子，并且EV71通过抑制miR-526a来抑制RIG-I介导的IFN-I产生。
【作者】徐昌志；
【导师】马清钧；钟辉；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，遗传学，2014，博士
【关键词】miR-526a；先天性免疫；EV71；CYLD；

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