CKIP-1在巨噬细胞增殖及极化过程中的功能及调控机制研究

【摘要】巨噬细胞是终末分化的细胞，在其发育过程中，M-CSF介导的增殖和分化起决定性作用。然而一旦分化成熟，组织中的巨噬细胞不再受M-CSF的诱导而增殖。在某些特定的生理或病理条件下，终末分化的组织巨噬细胞又能重新进入增殖状态，这一过程依然受到M-CSF的调控(IL-4也在这个过程中发挥重要作用)。巨噬细胞如何启动增殖，又如何进入静息状态，这种平衡是怎样维持的？目前依然不清楚。鉴于M-CSF是调节巨噬细胞增殖，分化，存活最为重要的细胞因子，研究其调控机制对于揭开巨噬细胞如何维持其数量平衡有重要意义。目前对M-CSF信号通路的转导途径已有较为深入的认识。相对于其激活机制，M-CSF的负调控机制研究的还不是很清楚。巨噬细胞参与炎症的发生，发展以及消解等各个阶段。在炎症反应的不同阶段，巨噬细胞会呈现不同的表型。在急性炎症反应（Th1型炎症反应）的起始阶段，巨噬细胞主要呈现M1（促炎）的表型，而在炎症的消解阶段巨噬细胞则呈现M2（抑炎）的表型。M1和M2是极化的两个极端，巨噬细胞可在这两个极端之间发生转换。最新的研究表明巨噬细胞的极化与非酒精性脂肪肝，动脉粥样硬化，自身免疫性疾病，肥胖以及肿瘤等多种疾病的发生发展密切相关。巨噬细胞的极化过程对于其自身功能的正常发挥起到至关重要的作用，然而决定极化的机制目前研究得还不是很清楚。鉴定更多在特定条件下调控巨噬细胞极化的分子，对于更好的了解巨噬细胞如何发挥功能具有重要意义。CKIP-1是一个与细胞骨架相关的蛋白，调节包括细胞增殖，分化，凋亡在内诸多生物学效应。我们前期的研究及芯片数据显示CKIP-1在免疫系统中，特别是巨噬细胞中特异性的高表达。本文的目的即是要鉴定CKIP-1在巨噬细胞发育及功能调节中的作用，研究其与巨噬细胞的数量及功能稳态调节之间的关系，并揭示其机制。本文的研究内容及结论主要包括以下两个方面：一）我们的研究发现CKIP-1是一个巨噬细胞增殖的负调控分子。1）CKIP-1缺失导致体外培养条件下巨噬细胞的增殖加快，存活能力增强：CKIP-1-/-的骨髓细胞在M-CSF介导的体外诱导分化条件下能得到比野生型对照更多的巨噬细胞；CKIP-1-/-BMDM处于S期和G2/M期的细胞比例比野生型高；BrdU掺入实验显示CKIP-1-/-BMDM增殖比野生型细胞快；CKIP-1-/-BMDM对M-CSF撤除造成的细胞凋亡不敏感；过表达CKIP-1能抑制M-CSF介导的32D-CSF1R细胞增殖。2）CKIP-1敲除小鼠脾脏及神经系统中巨噬细胞数量增加，脾脏增大：免疫组化结果显示CKIP-1-/-小鼠的脑组织及脊柱中Iba-1阳性的小胶质细胞（神经系统中的巨噬细胞）数量比野生型多；CKIP-1-/-小鼠脾脏增大，脾细胞的流式分析结果显示单核细胞和巨噬细胞的比例明显高于野生型。3）CKIP-1敲除小鼠骨髓中髓系细胞的比例上升，脾细胞形成G/M集落的能力增强：流式分析结果显示敲除小鼠骨髓中CD31-Ly6Chigh的单核前体细胞，及CD11b阳性的髓系前体细胞比例比野生型对照高；CKIP-1敲除小鼠来源的脾细胞在含有IL-3，IL-6和SCF的半固体培养基中形成集落的数量比野生型对照多。4）TRAF6参与了M-CSF介导的Akt激活：敲低TRAF6能抑制M-CSF介导的32D-CSF1R细胞增殖；在32D-CSF1R细胞中敲低TRAF6后，M-CSF介导的Akt磷酸化降低。5）CKIP-1负调控巨噬细胞增殖的机制是CKIP-1抑制M-CSF介导的Akt激活：在M-CSF刺激下，CKIP-1-/-BMDMAkt激活比野生型持续时间更长；在加入PI3K的抑制剂后，CKIP-1-/-巨噬细胞增殖加快的表型消失。6）CKIP-1是GKS3β的一个直接底物：加入λ磷酸酶后，p-CKIP-1抗体识别的条带消失；在普通SDS-PAGE中加入特异性结合磷酸基团的小分子化合Phos-tag能将磷酸化与非磷酸化的CKIP-1分离。二）我们的另一部分工作证明CKIP-1是一个调控巨噬细胞M1/M2极化平衡的重要分子。1)CKIP-1敲除小鼠对LPS介导的内毒素休克耐受：在致死剂量的LPS刺激下，CKIP-1敲除小鼠仍然有80%存活（此时野生型小鼠大部分已经死亡）；对LPS刺激后小鼠血清中的炎性因子的分析显示，CKIP-1敲除小鼠体内TNF-α，IL-6等促炎因子的水平明显低于野生型对照。2）CKIP-1-/-巨噬细胞分泌促炎因子的能力减弱：在用PGN，LPS，Poly（I:C）等不同的TLR配体刺激条件下，CKIP-1-/-BMDM分泌IL-6和TNF-α的水平比野生型低；用LPS刺激CKIP-1-/-腹腔巨噬细胞得到类似的结果。3）CKIP-1抑制M2极化：IL-4/IL-13刺激条件下，CKIP-1-/-BMDM比野生型细胞表达更高水平的M2标志基因Ym1和Fizzl；IL-4刺激条件下，CKIP-1-/-腹腔巨噬细胞表达Ym1的水平比野生型高；在Chitin诱导的Th2型炎症反应条件下，CKIP-1-/-小鼠腹腔细胞表达更高水平的Arg1，Ym1，Fizz1。4）CKIP-1调节LPS诱导的炎症反应中M1/M2的平衡：在LPS诱导的Th1型炎症反应条件下，CKIP-1-/-小鼠腹腔细胞中iNOS，TNF-α，IL-12等M1标志基因的表达水平比野生型对照低，而M2的标志基因Arg1，Ym1，Fizz1表达水平比野生型高。综上所述，我们的研究证明CKIP-1是一个巨噬细胞增殖的负调控分子：CKIP-1通过抑制TRAF6介导的Akt泛素化抑制M-CSF下游的PI3K-Akt通路的激活，同时CKIP-1又可被Akt的下游分子GSK3β磷酸化，进而降解。CKIP-1与Akt，GSK3β之间形成一个负反馈环路，共同调节M-CSF介导的巨噬细胞增殖稳态。我们还发现CKIP-1对于调节巨噬细胞M1/M2极化的平衡起重要作用：CKIP-1能抑制M2极化，促进M1极化；CKIP-1敲除小鼠对LPS引起的内毒素休克耐受；CKIP-1-/-巨噬细胞分泌促炎因子的能力减弱。在Th2型炎性因子IL-4/IL-13及Chitin的刺激下，CKIP-1-/-巨噬细胞表达更高水平的Ym1等M2标志分子。巨噬细胞增殖对于正常条件下巨噬细胞的发育，及某些病理条件下巨噬细胞正常功能的发挥有重要作用。M-CSF信号通路在巨噬细胞的增殖过程中扮演重要角色。我们的发现对于进一步理解巨噬细胞数量稳态调控的机制以及加深对于M-CSF信号通路的调节机制的认识有重要意义。巨噬细胞参与众多的生理及病理过程，极化对巨噬细胞正常发挥其生理功能起决定性作用。我们的研究为深入理解决定巨噬细胞极化的分子机制以及极化与炎症之间的关系提供了新的线索。
【作者】王义武；
【导师】贺福初；张令强；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】CKIP-1；M-CSF；Akt；巨噬细胞增殖；巨噬细胞极化；

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