登革病毒易感性相关的白纹伊蚊中肠特异性microRNA的鉴定、筛选与功能研究

【摘要】登革热、登革出血热（Denguehemorrhagicfever，DHF）是重要的虫媒传染病之一，广泛流行于热带和亚热带地区，埃及伊蚊和白纹伊蚊是其主要传播媒介。由于尚无有效的疫苗和治疗药物，登革热的防控仍然依赖于媒介蚊虫的防治。近二十年来，由于气候变暖、城市化进程加快以及国际间交流增加，其感染范围不断扩大，并时有暴发，因此，有必要发展新的媒介控制方法。而通过基因调控改变蚊虫媒介效能，研究新型媒介控制措施成为诸多学者关注的焦点。媒介效能的关键指标是媒介蚊虫对病毒的易感性，蚊虫体内存在多个阻止病原感染、扩散和传播的天然免疫防御屏障，其中，中肠是防止病原体入侵、建立体内病毒感染的第一个靶器官，病原体能否感染中肠上皮细胞，是影响蚊虫对虫媒病毒易感性的重要因素。目前，对于中肠感染屏障的分子机制尚不明确，因此也成为媒介蚊虫对登革病毒易感性调控机制研究的瓶颈所在。阐明中肠与病原体相互作用的分子机制，将使通过基因操纵来调节媒介效能，进而阻断病原传播成为可能，对制定新的媒介控制措施具有重要的理论意义。MicroRNA（miRNA）作为一类新型的基因调控因子，通过转录后水平调控基因的表达，在调控病毒感染和内在免疫调节中发挥重要作用。近年来，蚊类miRNA研究中，用RNA干扰（RNAi）的方法去除冈比亚按蚊Dcr1或Ago1（miRNA生成过程中必不可少的两种酶）会导致中肠疟原虫感染增加，而在埃及伊蚊中肠上皮细胞整合入稳定表达具有RNAi作用的反向重复序列后，其中肠登革病毒复制得到明显抑制，证明miRNA在蚊类中肠病原感染中发挥了重要作用，为研究蚊虫抗感染机制提供了新的思路。目前，在埃及伊蚊的研究表明登革病毒感染会引起埃及伊蚊身体及中肠组织miRNA的上调或下调，其中的一些miRNA在体外细胞实验中表现出对病毒复制的抑制或增强作用。但与白纹伊蚊中肠感染登革病毒相关的miRNA研究尚未见报道，而诸多研究证实，白纹伊蚊比埃及伊蚊中肠上皮细胞更容易感染登革病毒，但登革病毒从白纹伊蚊中肠扩散到其它组织的能力低于埃及伊蚊，说明两者中肠屏障的机制可能存在差异。虽有研究证实不同发育阶段白纹伊蚊存在不同种类miRNA,但miRNA的表达具有组织特异性，对于白纹伊蚊中肠内特异表达的miRNA种类及其与登革病毒感染的相关性研究尚无报道。本研究针对白纹伊蚊中肠特异性miRNA及其在登革病毒感染过程中的变化规律进行分析，并筛选部分miRNA进行体外细胞转染实验，试图通过研究探讨影响白纹伊蚊中肠细胞感染登革病毒的miRNA分子，为阐明中肠感染屏障机制奠定基础，同时也为设计新的方法来干扰或阻断蚊虫传播病原体的过程提供思路。本研究以野外采集的广州株白纹伊蚊为研究对象，在实验室条件下，用含有登革2型病毒（DENV-2）标准株（NGC）的人工血餐饲喂受试蚊虫，同时分别设立未吸血蚊和吸食不含病毒血餐蚊为空白对照和血餐对照，在饲喂后不同时间点获取中肠组织，以传统胶切割回收方法构建小RNA库并进行高通量测序及生物信息学分析，获得保守miRNA表达谱并预测新miRNA。进一步通过研究中肠miRNA感染后变化特点，分析感染与未感染中肠miRNA表达差异，寻找可能与登革病毒感染有关的miRNA分子。选择差异表达miRNA，用人工合成的miRNA类似物(mimic)和反义抑制物（inhibitor）转染C6/36细胞，研究目的miRNA对C6/36细胞内DENV-2复制的影响作用。结果：1．白纹伊蚊对DENV-2敏感性较高，中肠感染率高于身体其它部分感染率。本实验中白纹伊蚊对DENV-2的感染率在5-7天迅速上升至63.3%，之后平稳缓慢上升。中肠感染率高于身体其它部分感染率，两组均数配对t检验结果表明差异具有统计学意义，t=3.872，P=0.018。2．白纹伊蚊中肠miRNA表达种类丰富，并具有组织特异性。吸血和未吸血中肠样本中，通过高通量测序和生物信息学分析共鉴定112种保守miRNA并预测了43种新miRNA，茎环引物qRT-PCR验证了之前在该蚊种未曾发现的aal-miR-1174、aal-miR-2951、aal-miR-956-3p和aal-miR-956-5p的表达。3．白纹伊蚊吸血后中肠miRNA变化具有多种模式。吸血后1、2、5、7天，与未吸血蚊相比，miRNA变化特征被分为7大类，分别是先降再升、降-升-降、速升速降、慢升略降、持续升高、持续降低、基本不变，其中，先降再升、降-升-降是主要模式，构成比分别为20%和32%，几个高水平表达的miRNA，如aal-miR-184、aal-miR-956-3p、aal-let-7、aal-miR-281和aal-miR-34均属于此类。变化不显著的类型中，多数miRNA表达水平非常低。吸食含DENV-2血餐后中肠miRNA变化模式种类未变，但有些miRNA所属类型发生改变，如aal-miR-276-3p和aal-miR-275-3p由“先降再升”改变为“先升再降”。4．感染与未感染蚊中肠miRNA表达差异显著，上调种类多于下调种类。通过相同时间点配对比较感染与未感染蚊中肠miRNA表达差异，共筛选到74个差异表达显著的miRNA。按fold-change>2、归一化表达量至少在一组中不低于30的标准，进一步筛选出22个差异表达miRNA，其中16个呈上调表达，包括aal-miR-1767、aal-miR-276-3p、aal-miR-193-5p、aal-miR-1951、aal-miR-4728-5p、aal-miR-6134、aal-miR-622、aal-miR-1420b-5p、aal-miR-998-5p等，4个呈下调表达，包括aal-miR-1273f、aal-miR-4448、aal-miR-6666-3p和aal-miR-15-3p。而aal-miR-989和aal-miR-2941在不同的对比方式中分别表现出相反的变化趋势。5．差异表达miRNA在埃及伊蚊预测的靶基因数量多，具有多种功能，43种miRNA也在DENV-2预测到靶基因。用RNAhybrid软件预测差异表达的miRNA在埃及伊蚊基因组的靶基因，根据自由能高低筛选出靶基因数量为3608，结合位点有63386个，GO富集及代谢通路分析表明这些靶基因与多种生理功能有关。共有43种差异表达miRNA在DENV-2基因组预测到靶基因，分别位于DENV-2基因组非结构蛋白NS1、NS2A、NS3、NS4A、NS5和E蛋白等。6．C6/36细胞转染实验表明4个miRNA对细胞内DENV-2复制有影响作用。对5个随机选取的miRNA人工合成mimic和inhibtor，体外C6/36细胞转染实验表明，aal-miR-1767、aal-miR-4728-5p和aal-miR-276-3p能够增强C6/36细胞内DENV-2复制，aal-miR-4448能够抑制C6/36细胞内DENV-2复制。结论：1．首次对白纹伊蚊中肠特异表达的miRNA进行了鉴定分析，发现了新的在白纹伊蚊体内表达的保守miRNA，预测了新miRNA，丰富了蚊虫miRNA的种类。2．白纹伊蚊吸血后，中肠miRNA的变化复杂多样，但具有一定的规律性，随时间变化主要表现为7大类型，分别是先降再升、降-升-降、速升速降、慢升略降、持续升高、持续降低、基本不变。其中，先降再升、降-升-降是主要模式，分别占构成比的20%和32%。吸食含DENV-2血餐后，miRNA变化模式的类型未发生变，但有少数miRNA所属模式发生了改变。表达模式发生改变的miRNA可能在中肠感染DENV-2过程中发挥调控作用。3．感染与未感染蚊配对差异分析结果表明，经口感染DENV-2后中肠miRNA变化显著，且不同时期表现不同。感染后24h，多数miRNA表达上调，感染后48h，多数miRNA表达下调；摄入DENV-2后第7天，感染与未感染蚊中肠差异表达miRNA的种类最多，变化幅度最大。不同时间点差异表达的miRNA种类变化较大，表明白纹伊蚊中肠miRNA调控DENV-2感染的作用机制非常复杂，miRNA的变化呈现出瞬时性、复杂性和多变性的特点。4．体外细胞转染实验表明，aal-miR-1767、aal-miR-4728-5p和aal-miR-276-3p能够促进C6/36细胞内DENV-2复制，aal-miR-4448能够抑制C6/36细胞内DENV-2复制，这些miRNA可能在白纹伊蚊中肠感染DENV-2过程中也发挥重要调节作用。
【作者】苏建新；
【导师】赵彤言；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，病原生物学，2014，博士
【关键词】白纹伊蚊；中肠；microRNAs(miRNA)；高通量测序；登革病毒(DENV)；C6/36细胞；

【参考文献】
[1]沈银飞.神经根型颈椎病推拿治疗时间差异性的临床观察[D].黑龙江中医药大学,中医学（专业学位）,2013,硕士.
[2]姚泳.侧卧位经皮肾镜碎石术治疗复杂肾结石疗效分析（附38例报道）[D].山东大学,外科学（专业学位）,2013,硕士.
[3]吴海生.元建模在模型驱动架构中的应用研究[D].华东师范大学,2005.
[4]温海霞.禁毒管理部门办公自动化系统设计与实现[D].厦门大学,软件工程,2014,硕士.
[5]杨帆.基于CATIA的自动铺丝机运动仿真系统开发[D].哈尔滨工业大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[6]马建.生态文学研究：本体论检验，急需辩白问题以及美国基本图谱[D].南昌大学,英语语言文学,2012,硕士.
[7]向海波.一种来源于Enterobacter sp.CGMCC2487菌株的木糖苷酶基因的克隆、异源表达及产物的生化特性研究[D].湖北大学,微生物与生化药学,2011,硕士.
[8]周杰.基于AES和ECC的加密体制研究及硬件实现[D].西安电子科技大学,计算机系统结构,2011,硕士.
[9]王立军.高中古代诗歌教学现状、原因及对策研究[D].内蒙古师范大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[10]郑畅.石墨烯有望入选新材料“十三五”规划[J].半导体信息,2014,06:2.
[11]寇敏.公共旅游资源经营模式研究[D].青岛大学,旅游管理,2004,硕士.
[12]乔峰.Ag、石墨烯纳米流体的制备及性能研究[D].青岛科技大学,2010.
[13]孙一博.《最蓝的眼睛》中黑人女性身份的研究[D].西北大学,英语语言文学,2013,硕士.
[14]刘淑秀.针康法治疗非痴呆型血管性认知功能损害的临床研究[D].黑龙江中医药大学,康复医学与理疗学,2014,硕士.
[15]于文静.ZSM-5分子膜的合成与应用[D].天津大学,膜科学与技术,2013,硕士.
[16]聂文杰.竹集成材椅类家具五金连接的研究[D].南京林业大学,木材科学与技术,2004,硕士.
[17]张永田.TGF-β1在三氧化二砷诱导K562细胞分化中的作用与分子机制研究[D].济南大学,内科学,2012,硕士.
[18]彭拜.基于ARM的地源热泵U形埋管换热性能测试系统[D].杭州电子科技大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[19]沈涛.基于观测器的时滞系统鲁棒控制研究[D].河北科技大学,机械工程,2012,硕士.
[20]旺亚星.论微博对突发性社会群体事件舆论导向的影响[D].长春工业大学,社会学,2013,硕士.
[21]王繁盛.强骨关节冲剂联合双醋瑞因治疗膝骨关节炎的临床研究[D].南方医科大学,中西医结合临床,2012,硕士.
[22]梁之磊.我国老年图书出版现状及对策研究[D].北京印刷学院,传播学,2013,硕士.
[23]梁铁柱,秦臻,李德毅.FIBER:基于频繁项目表的频繁模式挖掘方法[J].军事运筹与系统工程,2002,02:2-5+46.
[24]邹燕燕.数据中心计算环境下基于语义模式的编译优化[D].中国科学技术大学,计算机系统结构,2014,硕士.
[25]翟允鹏.siRNA沉默Livin基因表达对肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响[D].山东大学,外科学,2013,硕士.
[26]王明周.中药复方对断奶腹泻仔猪肠道发育和肝脏抗氧化指标的影响研究[D].西南大学,临床兽医学,2014,硕士.
[27]芮小平,杨永国,奚砚涛.一种基于三棱柱的三维地质体可视化方法研究[J].中国矿业大学学报,2004,05:94-98.
[28]王昊.铝和ApoE ε4联合作用对SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化和Aβ表达的影响[D].山西医科大学,劳动卫生与环境卫生学,2013,硕士.
[29]程瑞.西安大唐不夜城空间模式与运行状况调查[D].西安建筑科技大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[30]于博.基于DSP的多总线通信接口模块设计[D].中北大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[31]向荣.和林格尔县域经济发展壮大问题研究[D].内蒙古农业大学,农业经济管理,2004,硕士.
[32]刘银方.论萧红小说的空间叙事[D].湖南师范大学,中国现当代文学,2013,硕士.
[33]王晓飞,王阳平.多种钢纤维含量活性粉末混凝土力学特性研究[J].建筑材料学报.
[34]危浡文.新型农村合作医疗保险：医保政策执行过程中的偏差研究[D].华中师范大学,政府经济学,2013,硕士.
[35]王冲.浅析外经贸中文函电的英译[D].华中师范大学,英语笔译,2013,硕士.
[36]赵文广,吴明安,张宜勇,王克友,范裕,汪龙云,魏国辉,车英丹.安徽省庐江县泥河铁硫矿床地质特征及成因初步分析[J].地质学报,2011,05:789-801.
[37]陈洋洋.SCP分析框架下的中国男子篮球职业联赛发展策略研究[D].山东大学,体育人文社会学,2013,硕士.
[38]赵春明.四川省石油学会物探分会第三次学术交流会在南充市召开[J].石油地球物理勘探,1986,06:700.
[39]牛自强.数据挖掘技术综述[J].安阳大学学报,2004,02:43-45.
[40]王斌,常雁红,智林杰.高产量制备石墨烯及其优异的重金属离子检测性能(英文)[J].新型炭材料,2011,01:31-35.
[41]陈静娴.客车车身总布置智能化设计原型系统的开发[D].扬州大学,车辆工程,2011,硕士.
[42]任超.商业方法的可专利主题地位的判断标准研究[D].苏州大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[43]陈少芳.综合客运枢纽内部换乘组织优化研究[D].吉林大学,交通运输规划与管理,2013,硕士.
[44]康重庆,陈启鑫,夏清.应用于电力系统的碳捕集技术及其带来的变革[J].电力系统自动化,2010,01:1-7.
[45]王江.鸟嘴方钢管节点静力性能试验研究[D].华侨大学,建筑与土木工程（专业学位）,2014,硕士.
[46]刘苏.针对便携式列控车载设备测试发码装置开展的研究[D].北京交通大学,2014.
[47]唐金霞.高效液相色谱联用共振瑞利散射技术在药物分析中的应用[D].西南大学,分析化学,2013,硕士.
[48]贾镜如.工业清洗技术的展望[J].组合机床与自动化加工技术.1992(10)
[49]汪阿鹏.瓦他拉尼中间体3-羟基-2-（4-吡啶基）-1H-茚-1-酮衍生物及新型水处理剂Fe-TMAL的合成[D].北京化工大学,化学工程（专业学位）,2013,硕士.
[50]刘尚龙.溶瘤病毒GLV-1h151增加胰腺癌放疗敏感性的作用研究[D].北京协和医学院,普通外科学,2014,博士.