红景天苷对失重性和杜氏肌萎缩的影响及机制研究

【摘要】一.红景天苷对失重性肌萎缩形成的影响及机制研究在航天飞行尤其是中长期航天飞行中，微重力将导致失重性肌萎缩的发生，主要以抗重力肌如比目鱼肌萎缩尤为严重，其特征性表现为肌肉重量丢失、肌纤维横截面积下降，并伴随慢肌纤维向快肌纤维类型转变。现有的物理对抗措施并不足以缓解失重性肌萎缩的发生，严重影响航天员在轨飞行任务的完成和返回地面后的健康恢复。面对我国空间站、载人登月等长期空间飞行的巨大挑战，亟需研发包括药物在内的新的有效防护对抗措施。我们前期的研究结果表明，尾悬吊模拟失重诱导的比目鱼肌萎缩中，对骨骼肌生长发育发挥重要调控作用的TGF-β1因子及下游关键信号介导因子Smad3被选择性激活；敲除Smad3可选择性抑制尾悬吊诱导的比目鱼肌肌肉重量丢失、肌纤维萎缩和慢肌纤维向快肌纤维类型的转变。以上结果提示Smad3可作为失重性肌萎缩对抗药物筛选的作用靶点。天然植物红景天及其有效活性成分红景天苷可以抑制肝肾脏组织中TGF-β1的表达，但未见红景天/红景天苷对骨骼肌中TGF-β1/Smad3通路表达影响的报道。本研究以野生型C57BL/6小鼠为实验对象，利用红景天苷或同等剂量PBS灌胃28天后，尾悬吊14天诱导失重性肌萎缩，分析红景天苷对失重性肌萎缩形成过程肌肉重量、肌纤维横截面积、快慢肌纤维含量以及TGF-β/Smad3信号通路表达的影响，并探讨Smad3在红景天苷影响失重性肌萎缩形成中作用的调控机制，主要研究结果如下：1、尾悬吊14天后，PBS处理组小鼠后肢背侧肌肉尤其是慢肌比目鱼肌肌肉重量明显减轻，肌纤维横截面积显著下降；红景天苷处理选择性抑制了尾悬吊诱导的慢肌比目鱼肌重量的丢失及肌纤维横截面积的下降，即对抗了尾悬吊诱导的比目鱼肌及其肌纤维的萎缩。2、在尾悬吊诱导的比目鱼肌萎缩形成过程中，骨骼肌特异表达的泛素连接酶Atrogin-1及MuRF1的表达明显增加；红景天苷处理后明显抑制了尾悬吊诱导的Atrogin-1及MuRF1的表达，提示红景天苷对抗失重性肌萎缩的作用可能与抑制了泛素蛋白酶体通路的激活有关。3、尾悬吊14天后，PBS处理组小鼠比目鱼肌慢肌纤维（MHC-I和MHC-IIa）含量明显减少，快肌纤维（MHC-IIb）含量明显增加；而红景天苷处理组小鼠比目鱼肌中MHC-IIa含量在尾悬吊后未发生明显改变，MHC-IIb的含量也比PBS处理组显著较少，说明红景天苷通过抑制尾悬吊诱导的MHC-IIa减少和MHC-IIb的增加显著对抗了慢肌纤维向快肌纤维类型的转变。4、Westernblot的结果表明，红景天苷处理后抑制了尾悬吊诱导慢肌纤维相关蛋白TroponinI-SS的减少和快肌纤维相关蛋白TroponinI-FS的增加，进一步验证了红景天苷对尾悬吊诱导的慢肌纤维向快肌纤维类型转变的对抗作用。5、尾悬吊诱导的比目鱼肌萎缩后，TGF-β1/Smad3信号通路明显激活，红景天苷处理明显抑制了尾悬吊诱导的该信号通路的激活。6、在成功构建携带有Atrogin-1启动子序列报告载体的基础上，将Smad3表达质粒与pGL-3-Atrogin-1体内共转染，结果表明，骨骼肌内过表达Smad3可以诱导pGL-3-Atrogin-1荧光素酶的表达增加，提示Smad3可以激活Atrogin-1的转录水平。7、利用生物信息学的比对结果表明，小鼠Atrogin1基因转录起始位点上游-2115～-2107区域存在一个可能的Smad3的结合位点，但ChIP的结果表明，在尾吊后的比目鱼肌中，p-Smad3并未与Atrogin-1启动子区域的该位点结合，该结果提示，尾吊时p-Smad3的激活并未对Atrogin-1发挥直接转录调控作用，而可能通过与其它蛋白相互作用的方式间接调控了Atrogin-1的表达。8、目前已知的和Smad3存在相互作用的蛋白中，FOXO是唯一可以对Atrogin-1发挥直接转录调控作用的因子，ChIP-re-ChIP的实验结果表明，尾悬吊诱导比目鱼肌萎缩后，在Smad3抗体沉淀的DNA片段中可以检测到FOXO对Atrogin-1启动子位点的结合，该结果证明，在尾悬吊诱导的比目鱼肌萎缩形成过程中，激活的p-Smad3是通过与FOXO结合间接发挥了对Atrogin-1的转录调控作用。9、利用ChIP-re-ChIP的实验结果表明，红景天苷处理通过降低p-Smad3与FOXO在Atrogin-1启动子区域的结合丰度，抑制尾悬吊诱导的Atrogin-1的表达增加。10、为了验证p-Smad3是否介导了红景天苷对尾悬吊诱导的慢肌纤维向快肌纤维类型转变的对抗作用，我们应用Smad3基因敲除小鼠（Smad3+/-）及其同窝出生的野生型小鼠（Smad3+/+）尾悬吊后证实，Smad3基因敲除小鼠同样可以对抗尾悬吊诱导的MHC-IIa减少和MHC-IIb的增加，提示红景天苷可能通过抑制尾悬吊诱导的p-Smad3的激活发挥了对肌纤维类型转变的对抗作用。11、在成功构建携带有MHC-IIa或MHC-IIb启动子序列报告载体的基础上，我们证实，TGF-β1刺激可以明显抑制pGL-3-MHC-IIa的荧光素酶表达，增强pGL-3-MHC-IIb的荧光素酶表达；过表达Smad3后，TGF-β1对pGL-3-MHC-IIa荧光素酶表达的抑制作用及对pGL-3-MHC-IIb荧光素酶表达的增强的作用更加显著，提示p-Smad3的激活可以抑制MHC-IIa的转录而增强MHC-IIb的转录。12、利用生物信息学手段对大鼠和小鼠MHC-IIa或MHC-IIb转录起始位点上游3000bp序列的比对结果表明，在MHC-IIa和MHC-IIb基因启动子区域各自存在3个和2个保守的Smad结合位点（Smadbindingelement,SBE）。13、利用ChIP的研究结果证实，p-Smad3可以直接与靠近MHC-IIa或MHC-IIb转录起始位点的SBE结合，分别位于MHC-IIa基因转录起始位点上游-54～-44bp区域以及MHC-IIb基因转录起始位点上游-630～-622bp区域。14、利用点突变策略成功将pGL-3-MHC-IIa和pGL-3-MHC-IIb报告载体的上述SBE位点突变后，逆转了p-Smad3对MHC-IIa和MHC-IIb基因的转录调控作用，证实p-Smad3调控MHC-IIa和MHC-IIb基因转录必需依赖同上述SBE位点的直接结合。15、ChIP实验结果表明，红景天苷处理后通过抑制尾悬吊诱导的p-Smad3的表达，降低p-Smad3对慢肌基因MHC-IIa以及快肌基因MHC-IIb启动子区域的结合丰度，从而对抗了尾悬吊诱导的慢肌基因MHC-IIa的减少和快肌基因MHC-IIb的表达增加。通过以上研究证实，红景天苷可以选择性抑制模拟失重诱导的慢肌比目鱼肌萎缩及其慢肌纤维向快肌纤维类型的转变，并揭示了Smad3在红景天苷对抗失重性肌萎缩形成过程中的调控作用，该研究不仅为失重性肌萎缩的防护对抗提供了有效的分子靶点，也为以红景天苷为主要有效药理活性成分的天然植物红景天治疗失重性肌萎缩提供了科学依据。二.红景天苷对杜氏肌萎缩动物模型的治疗作用研究杜氏肌萎缩（Duchennemusculardystrophy,DMD）是由位于人类X染色体的dystrophin基因缺失导致的一种临床严重致死性疾病。由于DMD患者肌纤维中缺失dystrophin，出生后肌肉的运动收缩，容易引起肌纤维反复损伤再生、持续性炎性反应和纤维化等主要病理改变。TGF-β1因子的高表达被认为在DMD骨骼肌纤维化形成中起着关键的作用。在本研究中，我们以DMD疾病公认的mdx小鼠为研究对象，利用中药红景天活性成分红景天苷抑制骨骼肌TGF-β1因子表达，并利用尾悬吊减少mdx肌肉运动收缩，探讨中药组分红景天苷和物理制动方法对DMD疾病模型mdx的治疗作用。主要研究结果如下：1、HE染色的结果证明，mdx小鼠腓肠肌炎性反应剧烈；红景天苷能明显减轻mdx小鼠腓肠肌的炎性反应，使炎性因子的表达恢复至正常野生型小鼠水平。2、相比野生型小鼠，mdx小鼠腓肠肌成肌因子表达显著增加；红景天苷处理抑制了mdx小鼠腓肠肌内成肌因子的表达，提示红景天苷处理后减轻了腓肠肌内的损伤修复反应。3、相比野生型小鼠，mdx小鼠腓肠肌明显纤维化、成纤维因子表达增加，尤其以collagenIα1增加最为明显；红景天苷明显的抑制了纤维化形成及collagenIα1的表达。4、相比野生型小鼠，mdx小鼠腓肠肌中慢肌纤维基因表达减少，快肌纤维基因表达增加；红景天苷处理明显抑制快肌纤维表达，该结果提示，红景天苷可以抑制mdx小鼠骨骼肌中慢肌纤维向快肌纤维类型的转变。5、mdx小鼠腓肠肌中TGF-β1/Smad3信号通路明显激活；但红景天苷处理明显抑制了mdx小鼠腓肠肌内TGF-β1/Smad3信号通路的表达，提示红景天苷对mdx小鼠骨骼肌病理损伤的改善作用与抑制TGF-β1/Smad3信号通路的激活有关。6、mdx小鼠后肢背侧骨骼肌中以腓肠肌炎性反应最为明显，尾悬吊14天能明显减轻mdx小鼠腓肠肌中的炎性反应，减少中心核含量及坏死肌纤维的数目。7、尾悬吊14天能引起mdx小鼠骨骼肌肌纤维的萎缩，该结果提示，通过尾悬吊减轻mdx小鼠骨骼肌病理损伤的同时，应注重防护对抗肌萎缩的形成。以上结果表明，红景天苷可通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路、减轻纤维化而缓解DMD病人病理损伤，而尾悬吊制动也能减轻mdx小鼠的炎性及坏死反应；该研究可为制定DMD疾病的综合治疗方案提供参考。有关制动配合使用红景天苷是否有可能在增强对DMD病理损伤改善作用的同时、减轻因运动减少而导致的肌肉萎缩等负面效应，尚有待进一步研究。
【作者】张鹏；
【导师】范明；陈晓萍；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】红景天苷；失重性肌萎缩；纤维类型转变；转化生长因子β1；杜氏肌萎缩；

【参考文献】
[1]吴冬雁.考虑荷载随机性影响的桥梁振动及噪声环境研究[D].浙江大学,桥梁与隧道工程,2014,博士.
[2]凌华强,龙胜春,项鹏远.主动形体模型法在肝脏CT图像分割中的应用[J].浙江工业大学学报,2012,04:450-453.
[3]戴海林.零售行业美陈设计人员的胜任力研究[D].苏州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[4]李长城,刘仍奎,段继锋.基于GIS的铁路货运营销系统研究[J].北方交通大学学报,2003,02:70-73.
[5]高巧缇.承载情感的意象之舟[D].渤海大学,中国现当代文学,2014,硕士.
[6]凌莉.自体外周血造血干细胞移植治疗重症肌无力的临床研究[D].广西医科大学,神经病学,2004,硕士.
[7]刘军.民国太原基督教青年会研究（1912-1937）[D].河北师范大学,中国近现代史,2012,硕士.
[8]刘昊.A公司在淘宝网电子商务平台的营销策略研究[D].吉林大学,工商管理,2012,硕士.
[9]马竟容.西部地区房地产品牌传播发展研究[D].北京印刷学院,传播学,2012,硕士.
[10]马伟霞.武汉市外来人口就业—居住关系及影响因素研究[D].华中师范大学,人文地理学,2013,硕士.
[11]孟闯.结核分枝杆菌抗原蛋白的表达、免疫特性分析及在牛结核病检测中的初步应用[D].扬州大学,遗传学,2011,硕士.
[12]夏建军,唐东磊,黄永平.三维地震采集观测系统压噪能力的估算及应用[J].石油地球物理勘探,2009,02:140-145+123-124+255.
[13]王洪.群体算法中能量函数极值点的几何特征[D].哈尔滨工业大学,计算数学,2013,硕士.
[14]刘清源.公民参与我国地方政府绩效评估的问题研究[D].西北大学,行政管理,2014,硕士.
[15]刘笑楠.虹膜图像块状纹理检测方法研究[D].沈阳工业大学,测试计量技术及仪器,2014,博士.
[16]王款.郑州廉政网络受众度研究报告[D].郑州大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[17]牛贵锋.油水分离旋流器三维数值模拟与结构优化[D].西南石油大学,2006.
[18]郑亦宁.唐代童蒙读物《蒙求》研究[D].首都师范大学,中国古代史,2014,硕士.
[19]陈心香.中国的地方侨务政治：政策执行鸿沟之解析[D].华侨大学,行政管理,2013,硕士.
[20]丁一.管理类书籍中词汇的英译汉实践报告[D].重庆大学,翻译（专业学位）,2014,硕士.
[21]温晓军.安全量子身份认证与信息签名协议的研究[D].北京交通大学,2008.
[22]樊红梅.Ⅱa_2期子宫颈鳞癌44例临床及预后相关因素分析[D].河北医科大学,妇产科学（专业学位）,2013,硕士.
[23]周丽辉.我国高校绩效预算管理研究[D].北京交通大学,2014.
[24]郭丽敏.几类分数阶微分方程边值问题的解[D].聊城大学,应用数学,2014,硕士.
[25]丁成.Aa CDT诱导人T淋巴细胞凋亡的初步研究[D].南京医科大学,口腔临床医学,2013,硕士.
[26]王文宏.EB病毒LMP-1、Wnt信号通路的β-cat及其靶基因c-myc在非霍奇金淋巴瘤中的表达和相互关系[D].青岛大学,病理和病理生理学,2003,硕士.
[27]娜仁朝克吐.一类无界算子矩阵的本质谱[D].内蒙古大学,数学,2014,硕士.
[28]陈冰冰.三套初级汉语听力教材练习的对比分析和使用建议[D].中山大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[29]张大伟.微生物中生产辅酶Q_(10)的研究[D].北京化工大学,生物化工,2007,博士.
[30]金丽娜.基于复杂网络的文献关联关系模型的建立与分析[D].北京化工大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[31]范宏,程浩忠,张节潭,金华征,金义雄,王一,钟明明.考虑电力系统安全的输电网规划[J].电力系统自动化,2007,11:35-38+73.
[32]王梅.农机企业知识管理及其解决方案的研究[D].中国农业大学,2005.
[33]吴晨昊.六年级学生数感的发展[D].华东师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[34]田习菲.醚化改性双氰胺—甲醛脱色絮凝剂的合成及应用[D].苏州大学,纺织工程（专业学位）,2014,硕士.
[35]裴品蘅.有限责任公司股东资格确认研究[D].郑州大学,法律,2013,硕士.
[36]崔婧.C轴倾斜的压电薄膜结构中的体声波传播[D].宁波大学,工程力学,2013,硕士.
[37]张冲.南宋归正人若干问题研究[D].河北大学,中国古代史,2014,硕士.
[38]沈天洁.基于BPR的综合医院门诊流程管理应用研究[D].浙江工业大学,2013.
[39]陈思霖.城镇化进程中农民工的城市融入与社会融合[D].华中师范大学,地方政府学,2013,硕士.
[40]任雪.完善我国纳税服务体系研究[D].吉林财经大学,公共管理,2014,硕士.
[41]郑圣.基于继电保护故障信息处理系统的主变保护高级应用的研究[D].浙江大学,2005.
[42]张丹慧,黄敏,佟振声.基于Agent的分布式入侵检测系统[J].计算机工程与应用,2004,35:160-162+169.
[43]高建荣,刘化彦,韩亮.基于工程实践与创新的化工类人才培养体系构建与实施[J].高教与经济,2012,04:40-43.
[44]刘飞.联盟协同模式在中捷立加事业部快速崛起中的应用研究[D].云南大学,高级管理人员工商管理（EMBA）,2012,硕士.
[45]李建辉.马克思主义视域下的政府诚信建设[D].山西财经大学,马克思主义基本原理,2014,硕士.
[46]崔杨.从生田流筝派看日本传统筝乐的主要特征[D].中国音乐学院,音乐学,2013,硕士.
[47]周玮.超标排污的法律规制研究[D].苏州大学,经济法学,2014,硕士.
[48]穆闫琨.中印高中数学教科书比较研究[D].东北师范大学,课程与教学论,2012,硕士.
[49]杨泽航.战后日本物流业发展及其启示[D].吉林大学,世界经济,2004,硕士.
[50]柯孔林,周春喜.商业银行信用风险评估方法研究述评[J].商业经济与管理,2005,06:55-60.