KIF22调控乳腺癌增殖和转移的双向作用及机制

【摘要】研究背景：驱动蛋白家族成员22(Thekinesinfamilymember22,KIF22)也称驱动蛋白样DNA结合蛋白(kinesin-likeDNAbindingprotein,Kid),既能结合于微管起正向微管驱动蛋白功能,也可结合于染色体DNA。KIF22作为驱动蛋白在有丝分裂中的作用已有深入研究,但其作为DNA结合蛋白的转录调节功能及在肿瘤发生发展中的作用和机制尚无报道。课题组前期研究发现,KIF22在乳腺原发癌组织较配对的癌旁正常组织表达上调,但在淋巴结转移癌组织较配对的原发癌组织表达下调,且乳腺原发癌组织中KIF22低表达的患者预后不良,提示KIF22在乳腺癌发生发展中起双向调节作用。为了研究KIF22的转录调节功能,课题组前期采用ChIP-on-Chip筛选KIF22的转录调控靶基因,发现CDC25C是潜在的KIF22下游靶基因,提示KIF22可能通过转录调控CDC25C表达促进肿瘤细胞增殖；由于KIF22在细胞有丝分裂中起关键作用,而KIF22低表达的细胞可能由于细胞有丝分裂异常形成多核化且低分化癌细胞,因而具有高转移潜能的内在生物学特性。本研究旨在阐明KIF22对乳腺癌细胞增殖和转移的双向调节作用及分子机制。方法：1.通过转染KIF22siRNA沉默肿瘤细胞中KIF22表达,采用MTT、流式细胞术、免疫荧光和Transwell实验观察沉默KIF22表达对肿瘤细胞生物学行为的影响,以确定其在肿瘤细胞增殖和转移中的作用；2.通过细胞同步化技术将肿瘤细胞分别同步在细胞周期的GO/G1、G1/S和G2/M期,通过流式细胞术、Immunoblot和免疫荧光实验观察沉默KIF22表达对细胞周期进程的影响；3.采用RT-QPCR、Immunoblot和免疫荧光实验检测沉默KIF22表达对EMT标志物和相关转录因子表达的影响。4.采用染色质免疫沉淀和双荧光素酶报告系统分析KIF22对下游靶基因CDC25C和的转录调节活性,进一步通过RT-QPCR、Immunoblot和点突变技术分析不同磷酸化水平的KIF22对CDC25C介导的CDK1活性的调节,以阐明KIF22对细胞周期的调节机制；5.通过SMAD荧光素酶报告质粒、RT-QPCR、Immunoblot和IFC实验分析沉默KIF22表达对TGF-β信号通路的调节,以确定沉默KIF22表达诱导乳腺癌细胞EMT的分子机制。结果：1.沉默KIF22表达的肿瘤细胞增殖能力显著降低,并伴随G2/M期阻滞,且多核化细胞比例增加；2.通过血清饥饿同步细胞于G0/G1期释放后,流式细胞术显示沉默KIF22表达不影响肿瘤细胞G1/S期进程,且CyclinA、P-Rb和CDK1表达没有改变；进一步通过双胸苷同步细胞于Gl/S期释放后,流式细胞术显示沉默KIF22表达促进S至G2期进程,CyclinB1和CyclinE表达显著改变,且免疫荧光显示沉默KIF22表达导致有丝分裂中期细胞比例增加,有丝分裂末期细胞比例减少；通过胸苷-Nocodazole阻滞细胞于G2/M期释放后,流式细胞术显示沉默KIF22表达导致有丝分裂退出延迟,CDK1pY15表达显著改变,且免疫荧光显示沉默KIF22表达导致有丝分裂中期细胞比例增加,有丝分裂末期细胞比例减少。证实沉默KIF22表达导致有丝分裂退出延迟；3.ChIP证实KIF22结合于CDC25C启动子区,且双荧光酶报告系统进一步证实KIF22可转录负调控CDC25C的转录活性。结合点突变技术证实该调节作用依赖于KIF22Thr463位点磷酸化,且磷酸化的KIF22抑制CDK1活性。证实Thr463位点磷酸化的KIF22通过调控CDC25C抑制CDK1活性；4.沉默KIF22表达促进乳腺癌细胞迁移和侵袭能力。沉默KIF22表达下调上皮标志物(E-cadherin和β-catenin),上调间质标志物(Vimentin和N-cadherin)表达,且沉默KIF22表达上调EMT相关转录因子Twist1、Snail和Slug表达。证实沉默KIF22诱导乳腺癌细胞EMT表型；5.沉默KIF22表达上调TGF-β1表达,SMAD荧光酶素报告质粒显示沉默KIF22激活TGF-β信号通路。沉默KIF22表达上调pSmad3表达,且Smad3核定位比例增加。证实沉默KIF22表达通过上调TGF-β1表达激活TGF-β信号通路。结论：1.沉默KIF22表达通过转录上调CDC25C表达,导致有丝分裂退出延迟,从而抑制肿瘤细胞增殖；2.沉默KIF22表达通过激活TGF-β信号通路,诱导乳腺癌细胞EMT表型,从而促进乳腺癌细胞转移。
【作者】余岳；
【导师】冯玉梅；
【作者基本信息】天津医科大学，肿瘤学，2014，博士
【关键词】KIF22；CDC25C；细胞周期；增殖TGF-β；EMT；转移；乳腺癌；

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