卟啉光动力纳米药物制备及肿瘤抑制研究

【摘要】研究背景和目的：化疗是恶性肿瘤治疗的主要手段之一。但传统化疗药物缺乏肿瘤选择性,毒副作用大,并且长期用药导致肿瘤多药耐药,是造成化疗失败的重要原因。目前,肝癌患者尚没有化疗方案显示出生存获益,因为肝癌患者普遍对化疗具有耐药性,对化疗不敏感。光动力疗法是近年来一种新兴的肿瘤治疗方案。光敏药物进入体内,富集于病灶后,在匹配吸收波长的激光作用下,能生成活性很强的单态氧,产生细胞毒性作用。但由于光敏剂水溶性较差,临床上很难直接注射；此外,光敏剂稳定性较差,很难在肿瘤部位长久富集,因此光动力治疗目前在临床只是做为辅助治疗方案。虽然这些治疗手段在目前的肿瘤治疗上发挥了重要的作用,但仍存在自身的弊端和无法完全抑制肿瘤的缺点,因此发展两种或多种肿瘤治疗手段协同作用的联合治疗方法,成为肿瘤治疗研究领域的热点。多功能纳米载体能够实现多种功能如长循环、靶向以及不同作用机制治疗方法的有效整合,满足临床对肿瘤联合治疗的需求。目前,已有大量关于多功能纳米药物对肿瘤联合治疗的报导,但由于其生物相容性及生物可降解性等方面的局限,极大的限制了在临床上的应用。本文拟设计并构建以生物体自有分子–血卟啉为基础的可直接用于临床注射的肿瘤靶向纳米药物,联合光动力学治疗与化疗,考察其逆转耐药乳腺癌细胞ADR/MCF-7化疗耐药的作用和相关分子机制,及在耐药乳腺癌、肝癌裸鼠荷瘤模型中的肿瘤靶向和体内抑瘤效果。研究方法：1)运用聚乙二醇修饰血卟啉合成光动力纳米材料HPP,负载抗肿瘤药物阿霉素制成光动力纳米药物HPPD。利用核磁共振分析纳米微粒的结构,透射电子显微镜及动态光散射研究其形貌及粒径。高效液相色谱分析检测药物的体外释放行为。2)运用MTT法检测游离药物组Dox,纳米药物组HPPD及联合光动力疗法处理组HPPD,ADR/MCF-7细胞中药物半数抑制浓度和细胞增殖能力的变化。流式细胞术定量检测不同处理组细胞对药物的摄取。激光共聚焦观察药物在耐药乳腺癌及亲本细胞中的药物分布和亚细胞定位。3)流式细胞术检测细胞凋亡。激光共聚焦检测细胞色素c的亚细胞定位,Westernblot检测线粒体凋亡通路关键成员的蛋白表达变化。4)建立耐药乳腺癌、肝癌裸鼠皮下模型及狨猴肝癌原位模型,Cy5.5荧光标记纳米药物HPPD,活体动物成像考察其肿瘤靶向性。5)尾静脉注射游离药物Dox或纳米药物HPPD,绘制肿瘤生长曲线,考察体内抑瘤效果。HE染色检测HPPD的生物安全性；HPLC检测药物在各组织脏器的分布；血清生化检测分析不同处理组阿霉素的心脏毒性。结果：1)核磁谱图结合透射电子显微镜结果表明,聚乙二醇通过酰胺键与血卟啉偶联形成具有核壳结构的光动力纳米胶束HPP,外形为球形或接近球形,粒径为24.38±1.02nm。HPP能够高效负载阿霉素,载药纳米微粒HPPD的粒径为35.60±2.05nm,体外释放结果表明药物具有显著的pH敏感释放特性,并且结合光照后,药物在弱酸性环境中的释放速率进一步加快。2)和游离阿霉素相比,HPPD结合光照治疗组对阿霉素耐药的人乳腺癌细胞(ADR/MCF-7)生长的抑制作用显著增加,有效逆转了细胞的耐药性,逆转指数高达12。3)激光共聚焦观察表明,游离阿霉素主要分布于ADR/MCF-7细胞的细胞浆；HPPD可实现阿霉素由胞浆到胞核的转位,结合光照治疗后,药物在胞核中的分布进一步增加。流式细胞术结果进一步证明,联合治疗法有效增加了耐药细胞对阿霉素的摄取。4)流式细胞术分析表明HPPD结合光照治疗显著诱导了耐药细胞的凋亡。激光共聚焦观察发现细胞色素c从线粒体释放到胞质中,Westernblot结果表明细胞浆中细胞色素c和凋亡诱导因子表达明显升高。5)皮下接种ADR/MCF-7细胞,构建异位移植瘤裸鼠模型,尾静脉给药,结果显示游离的阿霉素或HPP结合光照后不能显著抑制肿瘤的体内生长；而HPPD治疗裸鼠三周后,实现了肿瘤的完全消除,结合光照后,两周即可完全抑制肿瘤生长。此外,HPPD对于肝癌皮下模型也具有很好的肿瘤抑制效果。6)HPPD具有较好的体内肿瘤靶向性。ADR/MCF-7皮下成瘤裸鼠尾静脉注射给药后2h后,HPPD主要富集于肿瘤组织和肾脏；24h后,只在肿瘤部位观测到较强的荧光信号,表明HPPD有很好的肿瘤滞留性。此外MHCC-97H肝癌皮下成瘤裸鼠以及DENA药物诱导的肝癌原位模型狨猴体内也观察到类似的实验结果。7)尾静脉注射游离阿霉素和HPPD24h后,用HPLC考察药物在裸鼠体内分布。相对于游离药物组,HPPD在肿瘤内的药物分布提高至2-3倍,心脏分布降低了约55%。HPPD能显著降低阿霉素的毒性。在耐药乳腺癌和肝癌皮下荷瘤模型中,相对于游离药物组,心肌磷酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)表达明显降低；H&E结果表明,HPPD处理组对裸鼠的组织脏器没有毒性；血清生化试验表明,HPPD可有效减少阿霉素的心脏毒性。结论：本文设计并构建了一种结构简单、生物安全的基于生物体自有材料–血卟啉的纳米药物HPPD,实现了纳米体系内光敏剂与化疗药物的有效整合,体内的肿瘤靶向递送,以及化疗和光动力疗法的协同作用,为临床肿瘤联合治疗提供了新的思路与策略。
【作者】任玉；
【导师】张宁；
【作者基本信息】天津医科大学，肿瘤学，2014，博士
【关键词】卟啉；阿霉素；光动力疗法；肿瘤靶向；化疗增敏；

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