蛋白激酶AKT新底物的鉴定和功能研究

【摘要】AKT是P13K信号通路下游的重要节点分子,AKT通过磷酸化其一系列底物在促进细胞生长增殖、抑制凋亡、促进细胞运动等与肿瘤演进相关的多个方面发挥重要作用。AKT在静息期干细胞中处于隐匿失活状态,而在增殖活化的干细胞中被激活；与AKT相关的PTEN和PML等分子都与干细胞或肿瘤干细胞的干性维持相关；提示AKT信号可能参与干细胞或肿瘤干细胞的干性调节。核心转录因子Oct4、Klf4和Nanog对于胚胎干细胞干性维持极其重要,他们共同调节着多个干性相关的靶基因。SATB1是一种参与染色质高级构象形成的核基质结合蛋白和宏观基因调控分子,其在干细胞分化的早期阶段抑制干性基因的表达,扮演了分化因子的角色。SATB1、Oct4和Klf4等分子都拥有共同的AKT磷酸化模体序列(RxRxxS/T),我们推测AKT可能通过磷酸化这些干性调节因子,参与调控干细胞的干性维持或分化。在本课题研究中,我们应用体外激酶活性分析筛选了16个含有候选AKT磷酸化模体的干性或分化调节因子。鉴定出包括Oct4、Klf4、Bmi-1、Mbd3、Twist1、Fbxw7和SATB1等多个新的AKT磷酸化底物。进一步选取SATB1、Oct4和Klf4三个分子研究AKT参与干性调节的功能。我们证实了AKT磷酸化SATB1的47位丝氨酸；AKT磷酸化SATB1依赖于P13K信号；SATB1的47位丝氨酸磷酸化保护其免受凋亡信号降解。另一方面,我们证实了AKT磷酸化Oct4和KlN,磷酸化位点分别为228位苏氨酸和399位苏氨酸；AKT介导的Oct4、Klf4磷酸化会使二者更易被泛素化并进入蛋白酶体途径降解。在此基础上,我们证实了AKT信号加强了SATB1与Sox2的相互作用,这可能会阻滞Oct4/Sox2核心转录因子复合物的形成。在F9小鼠胚胎癌细胞的RA诱导分化模型中,AKT信号的活化伴随着干性丢失和分化进程。我们构建了稳定表达SATB1或其磷酸化位点S47突变型的F9细胞株,检测分化进程中相关基因的RNA和蛋白表达水平的结果显示,AKT介导的SATB1磷酸化在SATB1抑制Nanog表达和激活分化因子Bcl2、Nestin转录过程中起到关键作用。研究表明,AKT通过磷酸化调节干性和分化相关因子参与调控F9胚胎癌细胞的分化过程。综合起来,AKT不仅增强了SATB1对核心干性转录因子的抑制作用,还通过直接磷酸化促进干性因子Oct4、Klf4的降解,即AKT通过失活干性相关转录因子和激活分化调节蛋白参与干细胞分化过程。本研究初步阐述了AKT参与干细胞(也包括肿瘤干细胞)自我更新或分化的机制,有助于我们从干细胞的角度了解恶性肿瘤的演进过程(包括肿瘤发生和转移),也为临床诱导肿瘤干细胞分化和抑制肿瘤转移提供了新思路。
【作者】陈勃；
【导师】韩代书；
【作者基本信息】北京协和医学院，细胞生物学，2014，博士
【关键词】干细胞；AKT；Oct4；Klf4；SATB1；

【参考文献】
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