微小RNA对心肌损伤的动态评价及围术期心梗的早期预警&通气有效性预测心衰存活的研究

【摘要】循环miRs对心肌损伤的动态评价及围术期心肌梗死的早期预警围术期心肌梗死(PMI)是心血管外科的严重并发症之一。PMI会明显增加住院时间和费用,并使术后的发病率和死亡率增加。目前在术后早期诊断PMI还比较困难,尤其术后病人往往处于镇静状态,没有明显症状,ECG的表现也呈一过性和非特异性。检测肌钙蛋白I(cTnI)的升高可以促进诊断,可以将对PMI的诊断提前到术后24-48小时,但是仍然需要更早的诊断方法,以尽早发现PMI。MicroRNAs(微小RNA,miRNAs,miRs)是19-25个核苷酸左右的非编码RNAs,通过与mRNA的3’-UTR特异性结合,在转录后水平发挥调控作用,可以抑制：mRNA的翻译或可诱导之降解。miRNAs通过靶向结合基因中与成熟miRNA互补的序列,调控发育、细胞分化、增殖和凋亡,参与几乎所有生命体的生理和病理过程。尽管miRNA的功能没有被完全阐明,但目前已明确某些miRNA呈组织特异性。近来有研究表明循环中某些niRs的变化可以反映急性心梗病人的心肌损伤,然而,在心脏外科手术中循环miRNAs能否作为心肌损伤的标志物尚不清楚。目的：本研究目的在于筛选心肌损伤关联性和特异性高的miRs,并在临床验证其特异性和敏感性,以及miRs在冠脉搭桥术后早期对围术期心肌梗死的诊断预测能力。方法及结果：第一部分：循环miRs对心脏外科术后心肌损伤的动态评价入选停跳冠脉搭桥CABG患者和不停跳搭桥OPCAB患者各30例,在围术期7个时间点采集静脉血(术前,阻断开放后1,3,6,12,24,和48h),测定cTnl,CK-MB和miRs的水平。我们入选了心肌特异性较高的miRNAs(miR-133a,miR-133b,miR-208a,miR-208b,miR-499),采用特异性高的Taqman探针法实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)测定血标本的miRs水平,用2-△ct值表示,也可用变化倍数2-Δ△Ct表示。1.miRs的变化趋势停跳组miR-499在阻断开放后1,3,6,12和24h升为术前的23倍,72倍,25倍,8倍,和14倍(P<0.01);miR-133a在1,3,6和12h各为术前的28倍,23倍,6倍,7倍(P<0.01);miR-133b在1,3,6和24h各为术前的8倍,19倍,3.6倍,4倍(P<0.01);miR-208a仅在3h时升至术前的7倍(P<0.01);miR-208b与术前相比无明显差别(P>0.05)。不停跳组miR-499在侧壁钳开放后1,3和6h各为术前的13倍,11倍,8倍(P<0.01);miR-133a在1h即开始升高(6倍,P<0.01),3h达到高峰(10倍,P<0.01),6h即开始逐渐恢复至正常(P>0.05);miR-133b在1h升高(6倍,P<0.01),3h即开始逐渐恢复到术前水平(P>0.05)；miR-208a和]niR-208b在侧壁钳开放后升高,但均无统计学意义(P>0.05)。除miR-208b在停跳组与不停跳组之间无明显差异外(P>0.05),其余miRs在停跳组释放远高于不停跳组(P<0.05)。2.miRs与传统心脏标记物释放曲线的一致性MiRs和cTnI、CK-MB的测定来自同一血浆样本。各种标记物都显示了明显的先上升后下降的变化趋势,总体来看三者在时间曲线上具有一致性。停跳组miRs水平上升较快,一般在开放后1-3h即已达高峰,在6h明显下降,以后在12-24h略升高,48h恢复基线水平。而cTnl是在6h达高峰,miRs比cTnl更早达到高峰。CK-MB在3h达高峰,但其下降较慢,在12h才开始明显下降。不停跳组cTnl和CK-MB均在3h达到高峰,亦晚于miRs。3.miRs与cTnI和CK-MB的相关性停跳组循环miR-499,miR-133a,miR-133b峰值与cTnl峰值(miR-499,r=0.583,P=0.001;miR-133a,r=0.514,P=0.006;miR-133b,r=0.437,P=0.05)和CK-MB峰值(miR-499,r=0.579,P=0.002;miR-133a,r=0.527,P=0.005;miR-133b,r=0.397,P=0.04)明显相关,而miR-208a,miR-208b与cTnl(miR-208a,r=0.258,P=0.194;miR-208b,r=0.031,P=0.878)和CK-MB(miR-208a,r=0.127,P=0.528;miR208b,r=-0.132,P=0.512)不相关。在入选的miRs当中,miR-499和miR-133a最能反映心肌损伤。不停跳组miR-133b与cTnl相关性最大,但尚未有统计学意义(r=0.322,P=0.193),其余miRs与cTnl和CK-MB均无相关性。第二部分：循环microRNA对心脏外科围术期心肌梗死的早期预警研究前瞻性纳入CABG病人120例,其中3例按照排除标准予以排除。根据2012年ESC/ACCF/AHA/WHF对5型心梗的诊断标准,术后一周117例病人中有28例病人发生定义上的围术期心梗(PMI),89例无PMI,发生率为23%。测定术后6小时血浆生物标记物,包括cTnl,CK-MB,h-FABP,miR-499,miR-133a。采用ROC曲线分析miRs等标记物对PMI的诊断能力,pearson相关分析各标记物之间的相关性,并采用Logistic回归模型来分析患者基础状况与围术期因素中与术后PMI发生相关的危险因素。1.诊断试验结果分析ROC曲线分析表明术后6h的miR-499即能诊断PMI的发生,其敏感性为85.7%,特异性为93.3%,曲线下面积AUC(95%可信区间)为0.939(0.880-0.975)；而miR-133a敏感性为89.3%,特异性为67.4%,曲线下面积为0.845(0.767-0.905)；miR-499和miR-133a△Ct的cut-off阈值分别为<18.7477和<13.6417。cTnI敏感性仅为64.3%,特异性为86.5%,ROC曲线下面积为0.787(0.702-0.858)；CK-MB敏感性为78.6%,特异性为73.0%,ROC曲线下面积为0.800(0.716-0.869)；h-FABP敏感性为75.0%,特异性为75.3%,ROC曲线下面积为0.797(0.713-0.866)；cTnl,CK-MB,h-FABP的cut-off值分别为>2.98ng/ml,>11.3ng/ml,>14.57ng/ml。根据cut-off值,我们计算了阳性似然比+LR和其95%可信区间,分别为miR-499:12.71(10.8-14.9)vs.miR-133a:2.74(2.3-3.3)vs.cTnl:4.77(3.6-6.4)vs.CK-MB:2.91(2.3-3.7)vs.h-FABP:3.03(2.4-3.9)。2.两组间的比较有PMI和无PMI组患者的术前射血分数存在差异,心肺转流时间、主动脉阻断时间、术后机械通气时间,在有PMI组明显大于无PMI组(P<0.05)；PMI组的心肌坏死蛋白标记物水平明显高于无PMI组,分别为cTnI:4.82±0.74vs.2.00±0.15ng/ml,CK-MB:22.10±3.46vs.10.43±0.40ng/ml,h-FABP:27.44±3.25vs.11.09±0.88ng/ml(P<0.0001)。miRs的ΔCt值在PMI组明显低于无PMI组(miR-133a:12.25±0.32vs.14.18±0.1;miR-499:17.17±0.38vs.20.61±0.17),这表明术后6h循环中miRs含量PMI组远高于无PMI组(P<0.0001)。3.术后6h各标记物间的相关性分析术后6h循环miR-499与各蛋白标记物明显相关(cTnI,r=0.379,P=0.000;CK-MB,r=0.518,P=0.000;h-FABP,r=0.348,P=0.000)。循环miR-133a与各蛋白标记物亦呈明显相关性(cTnI,r=0.315,P=0.001;CK-MB,r=0.474,P=0.000;h-FABP,r=0.280,P=0.002)。4.多因素回归分析筛选PMI相关危险因素在117名患者中采用二分类Logistic回归分析,筛选术前、术中及术后早期相关临床因素中与PMI发生独立相关的危险因子,经过单因素分析,患者的术前左室射血分数、体外循环时间、主动脉阻断时间、术后机械通气时间均与术后发生PMI相关；把P<0.2的变量以及cTnI、CK-MB、h-FABP、miR-499、miR-133a等标记物纳入多因素回归分析,发现只有miR-499是术后PMI发生的独立危险因素。结论：对临床CABG患者的研究表明：血浆心肌特异性较高的,miR-499、miR-133a,达峰时间早于cTnI,且与传统标记物cTnI、CK-MB相关性好,释放与心肌损伤程度相关,显示了极高的敏感性和特异性；其中miR-499是冠脉搭桥围术期心梗的独立危险因素之一。心肺运动中通气有效性参数对心衰病人生存率的预测研究背景：分钟通气量与二氧化碳排出量(VE/VCO2)之间的相互关系,是常用来衡量人体呼吸系统与血液循环系统之间气体交换的通气有效性指标,在评估慢性心衰(CHF)病人疾病严重程度和预后预测方面已被认为比最大摄氧量更为有用。VE/VCO2之间相互关系的测定指标分为两大类：运动过程中不同时间段的VE/VCO2比值和用不同时间段数据计算的斜率(VE-vs-Vco2slope)。但是,这些不同时间段的比值和斜率中,哪个指标对心衰患者存活死亡预测价值更高却没有定论,本研究目的以心衰病人队列为研究对象,对通气有效性的不同计算指标对生存率的可预测性进行了评价研究。方法：纳入271例慢性心衰病人,NYHAII-IV级,均进行逐渐递增功率的症状限制性最大极限运动心肺运动试验(CPET),并进行跟踪随访(中位数479天)。线性回归计算得出4个不同的VE-vs-VCO2斜率,分别为：从运动开始到180s,到无氧阂(AT),到通气代偿点(VCP),和到运动结束时。计算得出5个VE/VCO2的比值,分别为静息60-180s,热身330-360s,AT(60s),最低值(90s),和最大运动(30s)时。研究终点为死亡或心脏移植,进行多因素分析。结果：心衰病人VE/VCO2最低值(41.0±59.2,141±30%预计值)和到通气代偿点的VE-vs-VCO2斜率(37.6±12.1,126±41%预计值)升高。对心衰病人生存率最好的预测指标是降低的VE/VCO2最低值；VE/VCO2最低值优于其他比值,到通气代偿点的VE-VS-VCO2斜率优于其他斜率。对于评价6个月的生存率,%预计值更好：对长期生存率来说,绝对值更佳。结论：VE/VCO2最低值,测量简单易行,是评估心肺气体交换通气有效性的最佳指标,与慢性心力衰竭患者的远期生存率有较好的相关性。
【作者】姚优修；
【导师】胡盛寿；
【作者基本信息】北京协和医学院，围术期医学，2014，博士
【关键词】生物标志物；围术期心肌梗死；冠脉搭桥术；miRNAs；miR-499；心肺运动试验；通气有效性；VE/CO2最低值；存活；心衰；

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