去乙酰化酶SIRT1基因表达及其多态性与冠心病的关联研究和Chr6p21.32区域SNP rs9268402与冠心病发病机制的探索

【摘要】第一部分：去乙酰化酶SIRTl基因表达及其多态性与冠心病的关联研究背景与目的：冠心病作为一种复杂性疾病,其发生发展与遗传因素密切相关。在细胞和实验动物水平的研究已经发现,编码去乙酰化酶的沉默交配型信息调节因子2同源体1（silentmatingtypeinformationregulation2,S.cerevisiae,homolog1,SIRT1）基因具有心血管保护作用。SIRT1基因的相关遗传变异的研究主要集中在衰老、肥胖,以及糖尿病、阿尔茨海默症等疾病。但是,SIRT1基因表达及其相关遗传变异与冠心病的关联研究尚未见报道。因此,本研究拟在基因表达及变异水平探索SIRT1与冠心病发生发展的关系,探索SIRT1在冠心病发病机制中的作用,以期发现冠心病的预防和治疗的新靶点。方法：1.应用人全基因组表达谱芯片（IlluminaHT12v3）比较冠心病组（18例）和正常对照组（6例）外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs）样本中基因表达谱差异。应用real-timePCR方法在一个独立的冠心病[58例,包括28例急性心肌梗死（acutemyocardialinfarction,AMI）患者和30例不稳定心绞痛（unstableangina,UA）患者]／对照组（175例）PBMCs样本中,检测SIRT1mRNA表达水平,验证表达谱芯片结果。2.应用HapMap数据库和Haploview4.2软件对SIRT1基因上下游10kb范围内的单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNPs）进行连锁不平衡分析；并应用3个生物信息网站对位于各个连锁不平衡区域中的非编码SNPs进行潜在功能分析,并从中筛选出4个候选功能SNPs。3.对本研究室已经完成的中国人群冠心病全基因组关联研究（genome-wideassociationstudy,GWAS）芯片数据中的上述4个候选SNPs与冠心病的关系进行关联研究；并应用Taqman技术在心绞痛病例对照样本（病例对照为1235例：905例）中验证GWAS芯片结果。4.在229例健康个体的PBMCs样本中,应用Taqman技术对4个候选SNPs进行基因分型,应用real-timePCR技术检测SIRT1基因表达水平,进而分析候选SNPs位点基因型与SIRT1基因表达水平的关系。结果：1.全基因组表达谱芯片结果表明,SIRT1基因是冠心病组和正常对照组之间表达差异最显著的基因之一,该基因在冠心病患者中表达水平显著低于对照组（P=3.55×10-5）。病例／对照独立样本中SIRTlmRNA表达结果表明,与对照组相比,冠心病组SIRT1表达水平下降为对照的42.22%（P=6.59×10-12）,其中AMI组和UA组SIRT1表达分别下降为对照的37.78%（P=5.37×10-10）和47.78%（P=7.45×10-7）。SIRT1表达水平在病例组中的显著下降验证了表达谱芯片结果。2.筛选出4个可能调控SIRT1表达的非编码SNPs:rs12778366、rs3758391、rs2273773和rs4746720。3.冠心病GWAS芯片结果分析未发现rs3758391、rs2273773和rs4746720与冠心病有关联,而rs12778366的C等位基因与心绞痛（病例对照为449：3998）关联（OR=1.25,P=0.032）,但是在另一独立样本分析中,rsl2778366的C等位基因与心绞痛（病例对照样本）不关联（OR=0.96,P=0.66）,未能验证该结果。4.健康人群研究中,首次发现SNPrs3758391的C等位基因与SIRT1的低表达水平相关（P=0.006）。rs12778366的少见变异C等位基因与较高的身高体重指数（BMI）相关（P=0.04）。rs2273773的少见变异C等位基因与较低的BMI和空腹血糖,较高的舒张压相关（分别P=0.03,P=0.04,P=0.03）。结论：1.本研究首次采用表达谱芯片和Real-TimePCR两种不同的方法,在两个样本量不同的独立样本中探索了SIRTl基因表达与冠心病的关系,发现SIRT1mRNA在冠心病患者中表达下降,提示SIRT1基因在人群具有心血管保护作用。2.本研究应用生物信息学手段在SIRT1基因及其上下游的非编码或无义突变SNP中筛选了4个有潜在功能的SNPs。3.本研究未能证明SIRT1相关的4个SNPs位点与冠心病有关联,该结果有待扩大样本量验证。4.在健康人群中分析所选4个SNPs的基因型与SIRT1基因表达的关系时,首次发现SIRT1启动子上游的功能性多态位点rs3758391的少见C等位基因与SIRT1的低表达相关,且既往研究表明rs3758391位于SIRT1上游p53的结合位点上,提示该SNP能够通过改变转录因子结合位点影响p53与SIRTl之间的相互作用,调节SIRT1的基因表达,进而影响冠心病的发生发展。第二部分：Chr6p21.32区域SNPrs9268402与冠心病发病机制的探索背景与目的：冠心病全基因组关联研究（genomewideassociationstudy,GWAS）确定的致病位点已经超过50个,目前已经进入对这些位点致病机制的研究阶段。中国人群冠心病GWAS风险区域6p21.32的关联最强的位点是位于基因间的rs9268402。本研究旨在探索研究该疾病风险位点rs9268402在冠心病发生中的作用及调控机制,为冠心病的预防与治疗的研究工作提供新的线索。方法：1.根据功能性单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）研究的经典方法,在健康人群的外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs）样本中（78例）,应用Taqman方法对rs9268402进行基因分型,应用real-timePCR技术检测该位点附近的编码基因C6orf10、BTNL2以及非编码基因HCG23、长非编码RNA（longnon-codingRNA,lncRNA）TCONS00012469的表达水平,分析rs9268402的基因型分布与这4个基因表达水平之间的关系。2.应用“DNA元件百科全书”（EncyclopediaofDNAElements,ENCODE）数据库、调节组生物信息网站RegulomeDB和HaploRegv2网站对rs9268402及其强连锁不平衡位点rs3817973（r2=0.74）和rs9268473（r2=0.74）进行潜在的功能性证据分析。3.rs3817973与rs9268402强连锁且被预测有潜在转录调控功能,克隆rs3817973所在转录增强子区域（chr6：32360556-32362973）,构建pGL3promoter-A/G重组表达载体,转染HEK293T细胞,分析双荧光素酶报告基因活性。4.应用电泳迁移率变动分析实验（electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA）分析结合rs3817973位点的人脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC）中的核蛋白因子。应用多重竞争EMSA（multiplexedcompetitorEMSA,MC-EMSA）方法筛选rs3817973位点A等位基因特异性结合的核蛋白因子。结果：1.研究发现冠心病易感多态位点rs9268402的风险等位基因G显著增加PBMCs转录本TCONS00012469的表达水平,表明lncRNATCONS00012469可能是rs9268402的靶基因。2.生物信息预测发现在HUVEC细胞中,冠心病易感位点rs9268402强连锁不平衡SNPrs3817973所在基因组区域有转录增强子表观遗传标记H3K27Ac和H3K4Me1的富集,该位点也处于DNaseI超敏感位点富集区和转录因子结合富集区,这表明rs3817973是潜在的功能性位点。且该SNP位于lncRNATCONS00012469的第一个外显子上。3.双荧光素酶报告基因实验表明rs3817973所在区域具有转录增强特性,但未发现两等位基因之间有差异调控活性。4.EMSA检测发现rs3817973位点不同等位基因对核蛋白因子的亲和力不同,A等位基因特异性结合核蛋白因子。MC-EMSA检测发现了A等位基因可能结合的5个核蛋白因子,分别为：雄激素受体、CREB结合蛋白、干扰素γ激活序列、干扰素刺激反应元件和干扰素调控因子1。结论：1.本研究首次发现6p21.32区域冠心病风险位点rs9268402的风险等位基因G与lncRNATCONS00012469的高表达相关,表明rs9268402可能通过lncRNATCONS00012469参与冠心病的发生发展。2.生物信息方法预测表明rs9268402的强连锁不平衡位点rs3817973所在区域具有增强子调控功能。3.双荧光素酶报告基因实验表明rs3817973所在区域具有增强子特性。4.本研究首次报道了rs3817973等位基因A特异性结合核蛋白因子。并发现了5个可能与A等位基因结合的核蛋白因子。表明该位点可能通过特异结合转录因子调控靶lncRNA的表达,进而调控冠心病的发生发展。本研究为冠心病GWAS风险位点的功能的进一步研究提供了方向和基础。
【作者】胡永艳；
【导师】顾东风；
【作者基本信息】北京协和医学院，遗传学，2014，博士
【关键词】冠心病；SIRT1；单核苷酸多态性；基因表达；关联研究；全基因组关联研究；长非编码RNA；

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