TRIB3参与内质网应激诱导的胰岛β细胞凋亡机制的研究

【摘要】高糖、高脂和细胞因子等刺激所导致的内质网应激,在2型糖尿病的胰岛素抵抗和胰岛p细胞功能衰竭中发挥了重要作用。胰岛p细胞对内质网应激极为敏感,由内质网应激导致的p细胞凋亡是2型糖尿病发病的重要环节。研究内质网应激诱导胰岛p细胞凋亡的分子机制对阐明2型糖尿病的发病机制以及糖尿病的防治都具有极其重要的意义。Tribble同源蛋白3(tribbleshomolog3,TRIB3)是近年发现的一种重要的应激相关蛋白,可被多种刺激因素诱导,具有广泛的生物学功能。TRIB3在胰岛素靶组织中的上调表达,参与了胰岛素抵抗的发生及2型糖尿病的进展。内质网应激反应可通过转录激活因子4(Activatingtranscriptionfactor4,ATF4)-C/EBP同源蛋白(C/EBPhomologyprotein,CHOP)诱导TRIB3表达,但TRIB3在内质网应激诱导的胰岛β细胞凋亡中的作用及机制尚不清楚。目的：通过检测糖尿病动物模型胰岛组织,以及内质网应激条件下胰岛p细胞系(INS.1)中TRIB3和CHOP的表达情况,分析TRIB3在糖尿病胰岛β细胞功能衰竭中的作用；并通过上调或敲降TRIB3,研究其对内质网应激诱导的INS.1细胞凋亡的影响,阐明TRIB3在糖尿病胰岛β细胞功能衰竭中的作用及机制。方法：为明确TRIB3是否参与糖尿病状态下胰岛的内质网应激反应,采用免疫蛋白印迹(westernblots)和实时荧光定量多聚酶链反应(real-timePCR)方法,分别检测发生糖尿病的GK大鼠胰岛和db/db小鼠胰腺中TRIB3和CHOP的表达水平；并利用毒胡萝卜素(Thapsigargin,Tg)于腹腔给予db/m小鼠在体内诱导胰岛p细胞内质网应激和细胞凋亡,检测p细胞caspase-3/7活性,westernblots检测β细胞TRIB3和CHOP表达水平。为分析TRIB3在内质网应激诱导胰岛β细胞凋亡中的作用,利用Tet-on系统构建可诱导表达TRIB3的大鼠胰岛β细胞系(TRIB3细胞系),采用real-timePCR、westernblots和细胞免疫荧光等方法检验所构建的p细胞Trib3基因的可诱导性。然后利用Tg或衣霉素(Tunicamycin,Tm)诱导内质网应激反应,采用DNAladder和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)方法观察Tg或Tm诱导的INS-1细胞凋亡；在我们构建的可诱导表达TRIB3的β细胞系中,分析TRIB3过表达或敲降(RNA干扰)后对Tg、Tm诱导p细胞凋亡的影响。进一步,为分析TRIB3在体内对内质网应激诱导胰岛p细胞凋亡的影响,将TRIB3细胞系移植到经链脲霉素(streptozotocin,STZ)造模的糖尿病小鼠肾包膜下,分别于腹腔单独给予Dox诱导TRIB3过表达,或单独给予Tg诱导内质网应激反应,或两者联合应用,尾静脉监测动物空腹血糖水平和ELISA检测胰岛素分泌水平,并应用免疫组化染色检测移植瘤细胞TRIB3的表达和TUNEL染色检测移植瘤细胞的凋亡为研究TRIB3介导内质网应激诱导胰岛β细胞凋亡的机制,首先在体外对TRIB3细胞系给予Dox诱导TRIB3表达,另给予Tg诱导内质网应激。然后采用westernblots检测核转录因子(NF-KB)的活性,real-timePCR检测诱导型一氧化氮合成酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)的表达,以及Griess法检测一氧化氮(nitricoxide,NO)的生成。并利用吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)来抑制NF-κB的活性,通过TUNEL染色检测PDTC的干预对Dox单独应用或Dox与Tg联合应用对β细胞凋亡的影响。最后进行体内实验来验证TRIB3的作用机制：免疫组化染色分别检测GK大鼠和db/db小鼠糖尿病发病前后胰岛p细胞NF-KB活性的改变,为体内研究提供实验依据。将TRIB3细胞系移植至STZ造模小鼠肾包膜下,在单独应用Dox或Dox与Tg联合应用的基础上,给予PDTC预处理2h进行干预,检测动物空腹血糖水平和胰岛素分泌水平。免疫组化染色观察PDTC干预对移植瘤细胞NF-κB活性的影响。TUNEL染色检测移植瘤细胞凋亡的情况。结果：TRIB3与糖尿病动物胰岛的内质网应激反应有关：糖尿病GK大鼠和db/db小鼠p细胞CHOP和TRIB3的表达明显上调。应用内质网应激药物诱导db/m小鼠体内胰岛p细胞凋亡,伴随有CHOP和TRIB3的表达明显上调,说明TRIB3与糖尿病状态下的内质网应激反应有关,并可能参与了胰岛β细胞凋亡TRIB3促进内质网应激诱导的胰岛p细胞凋亡：采用Tet-on系统,我们建立了Trib3基因可诱导表达的胰岛p细胞系。Dox对Trib3基因表达的诱导作用具有明显的时-效和量-效关系。利用该细胞系的分组研究发现,单独给予Dox组使TRIB3过表达以及单独给予Tg组诱导的内质网应激均可一定程度地诱导p细胞凋亡,两者联合组(Dox+Tg+)p细胞凋亡比单独给药组显著增加,组间统计学差异显著(P<0.001)。而敲降TRIB3的表达可显著减少内质网应激诱导的β细胞凋亡。说明TRIB3介导了内质网应激诱导的胰岛β细胞凋亡。体内验证实验发现,TRIB3细胞系在体内成瘤后,未给药组糖尿病动物空腹血糖下降急剧,单独给予Dox或Tg可减缓血糖下降幅度,但两者联合给药(Dox+Tg+)可使动物空腹血糖水平升高、胰岛素分泌水平降低。病理学检查发现其机制是在Tg诱导的内质网应激条件下,TRIB3过表达诱导了大量移植瘤细胞凋亡。TRIB3通过活化NF-KB促进内质网应激诱导的胰岛β细胞凋亡：Tg诱导内质网应激后,TRIB3过表达明显增强NF–κB活化,iNOS表达上调,NO和活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)生成增多,以及caspase-3活化。应用PDTC抑制NF-κB活化后,TRIB3过表达所诱导的细胞凋亡明显减少；而且在Tg诱导内质网应激条件下,TRIB3过表达所诱导的细胞凋亡减少得更明显。说明TRIB3通过激活NF-κB通路介导内质网应激诱导的胰岛p细胞凋亡。体内研究发现NF-κB在糖尿病GK大鼠和db/db小鼠胰岛内均活化的证据。进一步在我们以TRIB细胞系建立的移植瘤动物模型中,发现经PDTC干预后,在Tg诱导内质网应激条件下,TRIB3使NF-KB活化的作用明显受抑制。不仅如此,NF-κB活化受抑制后,在Tg诱导内质网应激条件下,TRIB3过表达不再使动物空腹血糖水平升高,反而出现了动物空腹血糖水平下降,血清胰岛素水平升高,p细胞凋亡减少的结果。这些结果进一步提示,TRIB3通过活化NF-KB通路发挥其促进内质网应激诱导胰岛p细胞凋亡的作用。结论：糖尿病状态下胰岛p细胞TRIB3表达上调,参与内质网应激诱导的胰岛β细胞凋亡,其机制是TRIB3使NF-κB通路活化并启动其下游的氧化应激和细胞凋亡途径促进β细胞凋亡
【作者】方妮；
【导师】娄晋宁；
【作者基本信息】北京协和医学院，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】TRIB3；内质网应激；β细胞；凋亡；NF-κB；糖尿病；

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