DNaseⅠ与2型糖尿病胰腺损伤关系探讨：从Bcl-2/Caspase-3通路探讨高血糖环境中DNaseⅠ增高与胰腺损伤的关系

【摘要】DNaseI是由260个氨基酸组成的单体糖蛋白,在Ca2+存在的条件DNaseI可以水解双链DNA,生成具有5’磷酸和3’羟基末端的寡核苷酸。有研究发现DNaseI与细胞凋亡、个体发育及自身防御等有着密切的联系。随着研究的深入发现DNaseⅠ不仅是一种可以降解外源DNA的水解酶,同时该酶还在细胞凋亡、降解坏死细胞的染色质方面起到很大作用。在细胞凋亡过程中,死亡细胞的DNA片段会被内源性的DNaseI降解形成180-200bp的DNA片段,最终完全被降解成核苷酸从而参与新的DNA的复制。除了广泛参与细胞凋亡的过程外,目前DNaseI已经被发现与系统性红斑狼疮和急性心肌梗死关系密切。然而作为一种主要由胰腺所分泌的酶,DNaseI与2型糖尿病之间的关系,却少有报道。在课题组前期研究过程中,我们发现DNaseI在2型糖尿病患者血清中出现了明显的升高。而据报道血清中60%-65%的DNaseI活性都是由胰腺所分泌的,因此我们推测血清中DNaseI的升高可能与胰腺存在着密切的关系。再者由于DNaseI的升高可以促进细胞的凋亡,基于此我们推测DNaseI的升高可能参与了糖尿病患者胰腺的损伤。因此本研究通过体内实验与体外实验相结合,来检测DNaseI在胰腺损伤过程中的重要作用。目的：观察DNaseI表达升高与2型糖尿病高糖所引起的胰腺损伤之间的关系,为进一步深入了解糖尿病发病机制及其并发症的发展提供新的思路,同时为胰腺损伤的分子诊断和基因治疗提供新的科学依据。方法：1、DNaseI在2型糖尿病患者血清及胰腺组织中的观察。1.1、本部分实验通过收集在我院就诊的2型糖尿病患者以及健康志愿者血清,采用辐射状酶扩散法对血清中DNaseI的活性进行对比分析,来探讨DNaseI在血清中的改变情况。1.2、收集本院近两年患有2型糖尿病及未患有2型糖尿病的胰腺癌患者手术切除的癌旁组织进行免疫组织化学分析,观察DNaseI在胰腺组织中的定位,同时对阳性表达区域进行半定量分析。2、体内实验研究胰腺组织中DNaseI的蛋白及mRNA表达变化。观察高脂饲料合并STZ诱导的2型糖尿病大鼠胰腺组织中DNaseI的表达变化来探讨DNaseI在高糖引起的胰腺损伤中的作用,通过免疫组织化学,WesternBlot及Real-timePCR对DNaseI的作用进行更加深入探讨。3、采用高糖刺激胰岛β细胞模型,验证高糖环境下DNaseI表达与细胞凋亡之间的关系。通过采用高糖培养基(30mmol/L),验证糖毒性对胰岛β细胞的损伤。通过外源性给予DNaseI及siRNA敲降,观察高糖环境中DNaseI与胰岛β细胞损伤之间的关系。4、DNaseI与糖尿病肾病损伤之间的关系探讨。本部分实验主要通过观察高脂饲料合并STZ诱导的2型糖尿病大鼠肾脏中DNaseI的变化,观察DNaseI与糖尿病肾病之间的关系。结果：一、临床样本结果(1)和健康对照组相比,2型糖尿病患者血清中DNaseI的活性出现了明显的升高(p<0.01),且该增高的趋势在不同性别之间无显著性差异。(2)免疫组织化学结果显示,在胰腺癌不伴随糖尿病的患者胰腺组织中DNaseI主要表达在胰岛细胞中,而在在胰腺癌伴随糖尿病患者的胰腺组织中,我们发现DNaseI在胰岛中的表达有升高的趋势(p<0.05),同时腺泡中也出现了大量的DNaseⅠ阳性表达(p<0.001)。二、体内实验结果(1)和正常组大鼠相比,我们发现高脂合并STZ诱导的大鼠血清中DNaseI的活性在第2周和第20都出现了明显的升高(p<0.05)。(2)免疫组织化学结果显示DNaseI在2型糖尿病大鼠胰腺中的改变与人类胰腺组织中变化趋势较一致,和正常大鼠相比,在第2周和第20周胰岛中的DNaseI均出现了明显的升高(p<0.05),同时伴随着DNaseI在腺泡中出现显著性的升高(p<0.001)。(3)和正常组相比,WesternBlot结果显示,糖尿病大鼠的胰腺组织中DNaseI的表达在第2周和第20周中均出现了显著性的升高(p<0.05)。但是Caspase-3则仅出现了升高的趋势而无统计学意义。Bcl-2在第2周出现显著性下降(p<0.05),而在第20周两组之间则无显著性差异(p>0.05)。Realtime-PCR结果显示两组之间在第2周和第20周mRNA表达均未出现明显的改变。三、体外实验结果(1)激光共聚焦结果显示DNaseI广泛存在于细胞质和细胞核中。(2)和正常对照组(11.1mmol/L)相比,高糖刺激(30mmol/L)可以明显引起INS-1细胞DNaseI,Caspase-3的表达升高(p<0.05)。DNaseI敲降后则可以显著降低高糖刺激的细胞内Caspase-3的表达(p<0.05),而敲降并未对Bcl-2的蛋白表达水平造成明显改变。(3)流式细胞仪结果显示,正常培养条件下INS-1细胞的凋亡率仅为7.9%,而高糖刺激则可以明显引起细胞的凋亡,凋亡率为18.1%,敲降细胞内DNaseI的表达后则可以明显减少高糖刺激后的细胞的凋亡(凋亡率为9.9%)。(4)外源性的给予胰岛β细胞5mU/ul和50mU/ul的DNaseI后,采用流式细胞仪进行观察,发现正常组的凋亡率为7.2%,而5mU/ulDNaseⅠ组的凋亡率为6.9%,50mU/ulDNaseI组的凋亡率为9.8%；予高糖刺激后在再进行相应浓度的DNaseⅠ刺激,我们发现高糖组的凋亡率为17.3%,高糖+5mU/ulDNaseⅠ组的凋亡率为21.8%,高糖+50mU/ulDNaseⅠ组的凋亡率为34.6%。并且我们也通过TUNEL实验对该部分的实验结果进行了验证,并且得到了较为一致的结果。四、大鼠肾脏DNaseⅠ表达和正常组相比,20周时模型组大鼠肾脏基底膜及足突出现明显的损伤；PAS结果显示肾小球中出现了明显的糖原沉积。WesternBlot结果显示在第2周和第20周时大鼠肾脏中DNaseⅠ的表达水平出现了明显的升高。Bcl-2和Caspase-3的变化趋势同胰腺组织中的变化趋势。结论：(1)2型糖尿病患者伴随着血清中DNaseI活性明显升高,同时在高脂合并SZT诱导2型糖尿病大鼠血清中,也发现了血清中DNaseI的活性出现显著性升高,我们推测DNaseI可能参与了糖尿病的发病过程。(2)高糖刺激可以引起胰岛β细胞内DNaseI的蛋白表达明显的升高,同时伴随着细胞凋亡率的显著增加；而敲降细胞内DNaseI的表达水平后可以明显降低细胞的凋亡率；在体内实验中也发现高血糖可以导致胰腺和肾脏组织中DNaseI的显著性升高,由此我们推测)NaseI可能参与了2型糖尿病胰岛β细胞的凋亡过程,同时DNaseI的升高可能也参与糖尿病肾病的发病过程。本研究首次发现在2型糖尿病患者血清中DNaseI活性出现明显的升高。同时我们也第一次发现在2型糖尿病患者和大鼠的胰腺腺泡组织中,DNaseI的表达出现了极显著的升高；通过体外实验证实了高糖刺激可以导致胰腺组织内DNaseI的表达明显上调,从而介导了高糖引起的胰腺细胞的凋亡的发生。通过本项研究可以为2型糖尿病胰腺损伤的预防及2型糖尿病的发病机制提供新的思路。
【作者】朱斌；
【导师】李平；
【作者基本信息】北京协和医学院，药理学，2014，博士
【关键词】2型糖尿病；DNaseI；凋亡；胰腺；胰岛；腺泡；

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