乌司他丁肺灌注液在深低温体外循环中未成熟肺保护及microRNA表达谱研究

【摘要】目的婴幼儿在经历过采用深低温低流量(DHLF)体外循环(CPB)转机方法的心脏手术后,由于多种病理生理原因,其肺损伤往往较年长儿严重,已成为患儿术后并发症的主要死因。近年来,有临床及实验报道,体外循环期间经肺动脉灌注肺保护液可减轻体外循环所造成的肺损伤。深低温低流量体外循环中未成熟肺损伤机制研究还不十分完善,在肺保护液的选择上尚无定论。目前,人们发现microRNA作为一类重要的基因调控因子在多种病理生理过程和疾病中发挥着多效作用。本研究中,我们从临床出发,通过建立稳定的乳猪深低温低流量体外循环模型,向肺动脉灌注乌司他丁肺保护液,探讨其对深低温低流量体外循环下未成熟肺脏的保护作用。并检测肺组织microRNA表达谱变化及对其潜在调控的靶基因和相关功能进行研究,进而为肺保护的研究提供理论依据。方法15只乳猪(14-21天,2.4-7.Okg)随机分为深低温低流量体外循环致肺损伤组(C组)、不含乌司他丁肺保护液灌注组(P组)、乌司他丁肺保护液灌注组(U组),各5例。均模拟临床操作建立体外循环模型。P组及U组于主动脉阻断心脏灌停后经肺动脉分别灌注不含乌司他丁肺保护液和乌司他丁肺保护液,C组无保护液灌注,主动脉阻断时间2小时期间使用深低温低流量(25℃,50ml/kg/min)转机1小时,维持循环稳定2小时。分别于CPB转机前,CPB停机、停机后1小时、2小时检测血流动力学指标,通气情况,血气变化,计算相关呼吸参数以比较和评价肺功能改变,同期各时间点抽取5ml肺静脉血离心后提取血清,实验结束后取右下肺组织匀浆离心提取上清,ELISA法测定血清及肺组织中肿瘤坏死因子a(TNF-αa),白细胞介素6(IL-6),白细胞介素10(IL-10),髓过氧化物(MPO),丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)含量,EMSA法检测肺组织中核转录因子kappaB(NF-κB)的活性,并对肺组织病理学评分、细胞凋亡情况、肺湿重干重比值进行比较。同时使用microRNA芯片技术对C组及U组肺组织miRNA表达与同龄同体重正常乳猪肺组织进行检测比较,筛选差异表达的microRNA,选取差异较明显的microRNA实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)进行验证。使用miRanda预测潜在靶基因,运用DAVID数据库对差异表达miRNA的可能靶基因进行GeneOntology分析和KEGG信号通路分析,并以qRT-PCR和ELISA分别检测肺组织中可能靶基因的表达。结果DHLF-CPB模型建立稳定成功,所有乳猪均出现肺损伤,并无明显血流动力学差异。实验终点时U组中肺功能指标、病理学评分明显优于C组及P组,同时湿干比及凋亡细胞比例较该两组明显降低。ELISA结果显示U组在实验终点时肺静脉血清中TNF-α,IL-6,MPO水平明显低于C组及P组,IL。-10,SOD水平则明显高于C组及P组,肺组织中IL-6,MPO含量明显低于C组及P组,IL-10,SOD含量明显高于C组及P组。实验终点时血清中MDA表达及组织TNFα,MDA含量U组与P组相比无明显差异,但均明显低于C组。EMSA结果显示U组NF-κB活性要明显低于C组及P组。通过miRNAmicroarray技术检测,同正常乳猪肺组织miRNA表达相比,C组中16个miRNAs,U组中8个miRNAs的表达发生了显著改变(P<0.05),运用荧光定量PCR对miR-21,miR-127,miR-145,miR-204表达进行验证,C组中,miR-127,miR-145,miR-204的水平明显降低,miR-21水平明显上升,U组除miR-204表达变化无统计学差异,其余miRNAs变化趋势与C组相同,具有统计学差异。与C组相比,U组miR-127,miR-204表达均抬高,miR-21表达降低。通过对miRanda预测的miRNA靶点进行归类分析,得到在体外循环肺损伤期间相关的重要通路,包括T细胞受体信号通路,P13K-Akt-NF-KB信号通路,RAS通路。预测靶基因磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3CG)、血管紧张素转化酶(ACE)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)PCR验证和ELISA检测结果均提示U组ACE、PTGS2表达水平及C组PIK3CG、ACE、PTGS2均明显升高。同时,U组ACE、PTGS2、PIK3CG表达水平均较C组显著降低。结论深低温低流量体外循环术后可造成严重的肺损伤,乌司他丁肺保护液能较好地改善未成熟肺肺功能指标,减轻炎性反应和氧化应激,减少肺内细胞凋亡,减轻肺损伤,可能与其抑制NF-KB活性有关。miRNA表达变化提示miRNA参与肺损伤和肺动脉灌注肺保护的过程。C组和U组肺组织中可能具有抑炎作用的miR-127,miR-145,miR-204表达下调与促炎作用的miR-21表达上调,提示miRNA参与肺损伤的作用机制与炎性反应、氧化应激密切相关。而U组中miRNA变化程度均小于C组,说明乌司他丁肺灌注液可调节相关miRNA达到肺保护的效果。通过对miRNA及其相关分子通路的发现将有助于今后我们对体外循环肺损伤机制研究及肺保护的研究。
【作者】李文雷；
【导师】李守军；
【作者基本信息】北京协和医学院，外科学，2014，博士
【关键词】深低温低流量体外循环；未成熟肺损伤；肺动脉灌注；乌司他丁；microRNA；

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