溶血磷脂酸对骨髓间充质干细胞凋亡和自噬的调节及其相互关系的研究

【摘要】干细胞移植因其可能促进心肌梗死(myocardialinfarction,MI)后损伤心肌的修复和再生已经成为当前的研究热点。骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,MSCs)具备许多其它干细胞没有的优点而被认为是细胞移植治疗心肌梗死的理想种子细胞。MSCs主要通过分化成心肌细胞、促进血管新生或者旁分泌作用等实现心肌损伤后的修复。然而,心肌梗死导致心肌缺血缺氧和大量氧自由基的产生使移植的干细胞存活率急剧下降,严重影响了干细胞效应功能的发挥。因此,深入了解心脏微环境中干细胞凋亡和抗凋亡机制能够为提高干细胞的治疗效果提供有效的理论依据。我们之前的研究已经对缺氧无血清和过氧化氢刺激诱导的MSCs凋亡及其机制进行了深入研究,并且进一步证明了溶血磷脂酸(Lysophophatidicacid,LPA)作为一种内源性的生物活性磷脂信号小分子可以通过G蛋白偶联的LPA受体有效抑制缺氧无血清(hypoxia/serumdeprivation,H/SD)诱导的MSCs的凋亡,但是LPA对过氧化氢诱导的MSCs凋亡是否起抑制作用尚不清楚。自噬是哺乳动物细胞降解和回收利用生物大分子和细胞器的主要代谢通路,在调节H/SD和氧化应激条件下细胞的存活和凋亡过程中起到了重要作用,但是自噬是否参与H/SD和过氧化氢条件下对MSCs的保护作用尚不明确。并且,LPA对自噬的作用是否有利于MSCs的存活也是一个未知数。因此,我们以大鼠骨髓间充质干细胞为研究对象,体外利用过氧化氢和缺氧无血清模拟心肌梗死后的氧化应激和缺血环境,研究LPA是否能够抑制过氧化氢诱导的大鼠MSCs凋亡,探讨自噬对过氧化氢和缺氧无血清环境诱导的MSCs凋亡所起的作用,并进一步验证LPA对自噬的调节是否参与LPA对MSCs凋亡过程的调节,并对其调节机制进行深入分析,最终达到对LPA调节的MSCs凋亡和自噬及其关系进行确认的目的。研究内容主要包括以下两部分：1.LPA对过氧化诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的调节及其机理研究(1)H202诱导大鼠MSCs凋亡呈浓度和时间依赖性。不同浓度过氧化氢(50,100,150,200,250μM)处理MSCs不同时间(0,2,4,6,8h),Hoechst33342染色显示,随着H202浓度升高皱缩的细胞核和断裂的DNA的比率不断升高,Westernblot结果实验显示随着处理时间延长活性caspase3的表达水平逐渐升高,其中250μMH2O2处理MSCs4h时,H202诱导的MSCs凋亡水平开始呈现出显著变化,因此这个处理条件作为制备氧化应激模型的基础条件。(2)LPA显著抑制H202诱导的MSCs凋亡。表现为：利用不同浓度LPA(1,5,10,25,50μM)分别预处理1h后用H202处理4h,Hoechst33342染色显示受损细胞形态百分比明显降低,Westernblot分析显示cleaved-caspase3的表达也明显降低,流式细胞学分析表明Annexinv+/pI和AnnexinV+/PI+细胞的比例明显降低,这些数据表明LPA能够显著抑制过氧化氢诱导的MSCs凋亡作用。(3)LPA抑制H202诱导的凋亡主要通过Gi蛋白偶联的Lpar3受体激活PI3K/AKT和ERK1/2途径实现。表现在：①Lpar1/3受体抑制剂Ki16425和Gi蛋白特异抑制剂PTX显著逆转了LPA的抗凋亡作用,表现为cleaved-caspase3的表达升高和AnnexinV+/PI-田胞百分比增加；②siRNA分别敲低Lparl和Lpar3,Westernblot和流式细胞术结果证明Lpar3介导了抗过氧化氢诱导的凋亡作用；③siRNA分别敲低Gi2和Gi3的实验证明Gi2和Gi3蛋白同时参与了LPA介导的抗凋亡途径；④用LPA分别处理MSCs不同时间(0,5,10,15,30,60min),发现LPA分别在5min和10min可以激活AKT和ERK1/2的磷酸化,Ki16425和PTX可以有效抑制LPA激活AKT和ERK1/2通路；⑤ERK1/2通路抑制剂U0126和P13K通路抑制剂LY294002显著抑制了LPA的抗凋亡作用。这些数据表明,LPA可以通过Gi蛋白偶联的Lpar3受体激活P13K/AKT和ERK1/2信号通路抑制过氧化氢诱导的MSCs的凋亡(4)过氧化氢诱导MSCs自噬对细胞存活起保护作用。表现为：①H202可诱导自噬标志物LC3BⅡ/Ⅰ比例的升高和P62表达下降,BECN的表达在各组间没有显著变化；②自噬激动剂GF109203x和抑制齐BafilomycinA1处理MSCs显示GF109203x可以显著减弱过氧化氢诱导的cleaved-caspase3的升高,而BafilomycinA1对过氧化氢诱导的MSCs凋亡没有任何显著作用；(5)LPA介导的抗过氧化氢诱导的凋亡作用不依赖于其促自噬作用。表现为：①与过氧化氢组相比,LPA可诱导自噬标志物LC3BⅡ/Ⅰ比例升高,P62保持不变；②自噬抑制剂BafilomycinA1对LPA的抗凋亡作用没有显著影响。这些结果初步证明LPA介导的抑制过氧化氢诱导的凋亡作用与其诱导的自噬作用没有关系。第一部分小结：过氧化氢可以显著诱导MSCs的凋亡,LPA预处理可以显著抑制过氧化氢诱导的MSCs凋亡作用,LPA的这种抗凋亡作用通过Gi蛋白偶联的Lpar3受体激活PI3K/AKT和ERK1/2信号通路实现,过氧化氢诱导的自噬对MSCs存活起保护作用,LPA虽然可以促进MSCs自噬但是其促自噬作用并没有参与LPA抵抗过氧化氢诱导的损伤过程,表明在氧化应激条件下LPA的抗凋亡作用与LPA的促自噬作用没有关系。2.自噬途径在LPA抗缺氧无血清诱导的MSCs凋亡过程的作用及机制研究(1)H/SD诱导的自噬作用对MSCs存活起保护作用。表现为：①H/SD处理MSCs不同时间点(6,12,24h),结果显示H/SD处理6h已经可以显著诱导凋亡相关蛋白cleaved-caspase3升高和Bcl2/Bax比值下降,自噬相关蛋白LC3BⅡ/Ⅰ显著升高和P62降低,而BECN的表达没有显著变化；②利用自噬促进剂GF109203x和雷帕霉索(Rapamycin)以及自噬抑制剂巴弗洛霉素(BafilomycinA1)和3-MA分别预处理MSCs90min后,进行H/SD处理6h,发现GF109203x和Rapamycin可以显著减弱cleaved-caspase3升高和Bcl2/Bax下降,而BafilomycinA1和3-MA进一步加强了cleaved-caspase3升高和Bcl2/Bax降低。初步研究表明H/SD处理MSCs6h诱导的自噬对MSCs的存活起保护作用。(2)H/SD6h条件下LPA促进MSCs自噬参与了LPA的抗凋亡过程。表现为：①LPA呈浓度依赖的进一步促进LC3BⅡ/Ⅰ升高,P62在加入LPA前后没有发生显著变化,表明在H/SD6h条件下LPA可以进一步激活MSCs自噬；②不同浓度LPA(1,5,10,25,50μM)预处理MSCs可以显著抑制cleaved-caspase3升高和Bcl2/Bax降低；③利用自噬抑制剂BafilomycinA1口3-MA预处理MSCs90min后,LPA处理60min,之后进行H/SD处理6h,发现LPA抑制H/SD诱导的MSCs凋亡作用被部分抑制,表明LPA的抗凋亡能力下降与自噬途径被抑制有关。③LPA促自噬通过Gi蛋白和其它G蛋白偶联的Lpar1/3受体实现。表现为：①Lparl/3受体抑制剂Ki16425可以显著抑制LPA的促自噬的作用；②Gi蛋白抑制剂PTX可以部分抑制LPA诱导的自噬作用。表明LPA的促自噬作用通过Lpar1/3受体偶联的Gi或其它类型的G蛋白实现。(4)LPA促进MSCs自噬依赖于ERK1/2和AMPK途径。表现在：①我们课题组之前的结果已经证明LPA可以通过Gi蛋白偶联的Lpar1/3受体激活AKT和ERK1/2的磷酸化信号通路,本研究中我们进一步证明LPA可以激活AMPK的磷酸化,并且Ki16425预处理可以抑制LPA促进AMPK磷酸化作用,而PTX预处理对AMPK的磷酸化没有影响；②PI3K抑制剂LY294002、ERK1/2抑制剂U0126和AMPK抑制剂CompoundC处理均可以显著减弱H/SD诱导MSCs凋亡；③LY294002、U0126和CompoundC预处理MSCs后,只有U0126和CompoundC可以降低LPA的促自噬作用。这些数据表明ERK1/2和AMPK通路参与了LPA的促自噬作用。第二部分小结：H/SD处理MSCs6h可以显著诱导细胞的凋亡和自噬,H/SD诱导的自噬有利于MCSs的存活,并且在H/SD6h条件下LPA能够促进MSCs自噬作用参与了LPA的抗凋亡过程,LPA的促自噬过程主要通过Lpar1/3偶联的Gi蛋白介导的ERK1/2通路和Lpar1/3偶联其它G蛋白介导的AMPK通路实现。本研究首次证明了过氧化氢诱导的MSCs凋亡可以被LPA所抑制,并且发现LPA的这种抗凋亡作用主要通过Lpar3受体偶联Gi蛋白激活PI3K/AKT和ERK1/2实现,这与之前研究发现的LPA抑制缺血无血清诱导的MSCs相结合,揭示了LPA在将来干细胞移植治疗心肌梗死的临床应用中的重要价值。此外,本研究首次分析了,过氧化氢和缺氧无血清条件下LPA可以促进MSCs的自噬,虽然LPA的促自噬作用在其介导的抗过氧化氢诱导的MSCs凋亡中没有发挥作用,但被证明参与抵抑制缺氧无血清诱导的MSCs凋亡,并进一步分析得到H/SD条件下ERK1/2和AMPK参与了LPA的促自噬作用,为进一步改善MSCs移植治疗心肌梗死的临床应用提供了新思路。鉴于自噬作用参与多种细胞生物学过程(细胞的增殖、分化和迁移等),深入研究干细胞中LPA对自噬的调节与多种细胞学行为之间的关系将会对未来LPA应用于干细胞移植治疗心肌梗死提供更有利的证据。
【作者】王宪云；
【导师】陈曦；
【作者基本信息】北京协和医学院，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】溶血磷脂酸；骨髓间充质干细胞；过氧化氢；缺氧无血清；凋亡；自噬；

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