肠道病毒71型2C蛋白调节NF-κB活化的机制研究

【摘要】肠道病毒71型(enterovirus71,EV71)可引起手足口病、严重的神经系统并发症如无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿等,具有较高的病死率和致残率。EV71属于小RNA病毒科肠道病毒属,是单链正股RNA病毒,其正链的RNA基因组被翻译成一个多聚蛋白,经过自身剪切,最终形成结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4和非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D。目前EV71的致病机理有待阐明。EV712C蛋白含329个氨基酸,分别与同属的柯萨奇病毒A16型和脊髓灰质炎病毒的同源性达97.5%和63.3%,相对保守。NF-κB蛋白家族在宿主抵抗病毒感染过程中起着关键作用。在宿主细胞的正常生理状态下,p65和p50与IκB-α/β在细胞质中形成非活化状态的三聚体,在受到外界多种信号刺激下,通过信号转导途径,IκB-α/β被降解,活化后的p65和p50二聚体从细胞质中迁移到细胞核中,与细胞核中特异DNA序列结合,启动基因转录,引起细胞因子、趋化因子、粘附因子等表达,使得宿主对病毒侵染产生天然免疫和适应性免疫应答。目前可通过自身蛋白抑带NF-κB信号途径的病毒有cowpoxvirus,coxsackieviruses,hepatitisCvirus,HIV-1,poliovirus,SARS-coronavirus等。我们通过酵母双杂交方法以EV712C蛋白为诱饵进行了大规模的酵母双杂交筛选人cDNA文库,得到其中一个候选蛋白是p65。我们通过免疫共沉淀和GSTpulldown技术证实了EV712C和p65相互作用,经激光共聚焦观察EV712C和p65在细胞内存在共定位。为了明确与2C相互作用的p65蛋白区域,我们针对p65进行了截短突变,最终将作用区域定位于194-290氨基酸p65的IPT结构域,此结构域是p65与p50形成二聚体的结合区域,实验表明2C能通过与IPT结构域相互作用削弱p65和p50的结合。为明确与p65的相互作用的2C蛋白区域,我们针对2C进行了截短突变,将作用区域定位于105-125氨基酸和126-263氨基酸。通过NF-κB报告基因检测发现105-125和126-263氨基酸片段都能抑制NF-κB舌化。我们将2C截断突变体1-104,1-113,1-117,1-121,1-125氨基酸区段进行了报告基因检测,发现五个突变体皆抑制NF-κB活化。据报道,2C1-125aa抑制IKKβ磷酸化而抑制NF-κB活化,我们采用免疫共沉淀方法,发现IKKβ与2C1-104和105-125氨基酸皆有作用,2C105-121氨基酸与IKKβ相互作用而不与p65IPT功能域相互作用。综上所述,我们首次鉴定了EV712C与p65相互作用,并阐明2C可通过与p65的IPT结构域结合抑制p65和p50二聚体形成,提出了EV71拮抗天然免疫的新机制。
【作者】杜海威；
【导师】金奇；
【作者基本信息】北京协和医学院，微生物学，2014，博士
【关键词】肠道病毒71型；2C蛋白；p65；NF-κB；酵母双杂交；

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