CXCL12-CXCR7轴在胰腺癌迁移侵袭中的作用及机制研究

【摘要】研究背景胰腺癌已被公认为预后极差的恶性肿瘤之一,其死亡率接近发病率。美国癌症协会对美国肿瘤发病率及死亡率的统计结果表明,胰腺癌占全部肿瘤死亡原因的第四位,其发病率有逐年升高趋势,过去10年间,胰腺癌的发病率增高了15%左右,但其5年生存率依然在5%以下。由于缺乏特异的临床表现,难以早期诊断,往往发现时已有淋巴和血运转移,失去根治性治疗机会。其死亡的主要原因是发现时已处于进展期,很多患者在确诊时肿瘤已包绕血管或发生远处转移。目前胰腺癌的侵袭转移机制尚不明确,因此明确胰腺癌侵袭与转移的分子机制对胰腺癌的治疗有重要的意义。趋化因子既往被认为主要参与炎症反应。近年来,研究发现其在肿瘤的发生发展,尤其是在迁移侵袭方面发挥重要作用。本课题组前期通过DMBA诱导大鼠胰腺癌模型,进行基因芯片筛查,确定CXCR7为大鼠胰腺癌和正常胰腺组织显著差异表达的重要基因之一。CXCR7是近年来新发现的趋化因子受体,在肿瘤的发生发展,尤其是侵袭转移方面发挥重要作用。CXCL12作为CXCR7的重要配体,在许多肿瘤细胞中显著表达,而正常细胞则很少表达。许多研究表明CXCL12-CXCR7轴可促进肿瘤生长及侵袭转移,但其对胰腺癌侵袭转移的影响及相关机制仍然未知。因此,探讨CXCL12-CXCR7轴在胰腺癌的侵袭转移中的作用对于加深我们对胰腺癌分子机理的认识有重要意义。研究目的1)观察CXCL12-CXCR7轴对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响；2)探讨CXCL12-CXCR7轴在胰腺癌细胞中的作用机制；3)体内实验验证CXCR7对胰腺癌裸鼠移植瘤生长和转移的影响；41分析CXCL12和CXCR7在胰腺癌患者预后评估中的价值。研究方法1)通过慢病毒载体将CXCR7的干扰miRNA或CXCR7基因导入胰腺癌细胞株BxPC-3和Capan-1中,经过抗性筛选,建立稳定沉默和稳定过表达CXCR7的胰腺癌细胞株。2)CCK8法观察各组细胞增殖,Transwell法确定各组细胞迁移和侵袭,Westernblot检测mTOR通路相关蛋白表达及磷酸化,探讨CXCR7对胰腺癌细胞表型的影响及相关机制。3)不同浓度CXCL12处理细胞(及在CXCL12加入的情况下,再加入或不加入CXCR4的抑制剂AMD3100),Transwell法检测细胞株的迁移和侵袭,Westernblot检测相关蛋白表达及磷酸化,探讨CXCL12影响胰腺癌细胞生物学行为的分子机制。4)在稳定过表达CXCR7的胰腺癌细胞株中加入mTOR的抑制剂雷帕霉素或Torinl,Transwell法检测细胞迁移和侵袭,Westernblot检测mTOR通路蛋白表达及磷酸化。免疫共沉淀检测CXCR7和mTOR蛋白之间的相互作用。在稳定沉默CXCR7的胰腺癌细胞株中Westernblot法检测mTOR下游ROCK通路蛋白的表达。在稳定沉默CXCR7及亲本胰腺癌细胞株中,加入mTOR抑制剂雷帕霉素或Torinl,免疫荧光染色检测F-actin的表达。5)建立BALB/C-neu雌性裸鼠胰腺癌原位移植瘤肝转移模型,分别原位植入各组细胞。2个月后处死裸鼠,测量胰腺肿瘤体积,计数肝脏转移灶数目。6)免疫组织化学染色探讨CXCL12和CXCR7在胰腺癌中的预后价值。研究结果1)以BxPC-3和Capan-1为亲本株,成功构建稳定沉默或过表达CXCR7蛋白的胰腺癌细胞株Si-CXCR7和OE-CXCR7。2)CXCR7稳定沉默或过表达胰腺癌细胞株的增殖与对照组比较无明显变化(p>0.05);CXCR7稳定过表达的胰腺癌细胞的迁移和侵袭较对照组明显增强,伴有mTOR、4EBP1和P70S6K蛋白磷酸化水平的明显升高；而CXCR7稳定下调的胰腺癌细胞呈现相反的趋势,相应蛋白的磷酸化水平亦明显降低；无论稳定过表达或稳定沉默CXCR7的胰腺癌细胞株的AKT及p-AKT蛋白表达无明显变化。3)不同浓度的CXCL12处理胰腺癌细胞株BxPC-3及Capan-1后,两株细胞的迁移和侵袭明显增强,CXCR7蛋白表达显著上调,mTOR、4EBP1和P70S6K磷酸化水平也明显升高。在加入CXCL12的同时,加入CXCR4抑制剂AMD3100并未引起细胞迁移和侵袭(p>0.05)、CXCR7表达、mTOR、4EBP1和P70S6K蛋白表达及磷酸化水平水平的明显变化。41在稳定过表达CXCR7的细胞中加入mTOR的抑制剂雷帕霉素和Torinl之后,细胞的迁移和侵袭明显降低,mTOR、4EBP1和P70S6K磷酸化水平明显降低。免疫共沉淀实验显示mTOR蛋白和CXCR7之间存在直接结合。稳定沉默CXCR7的细胞株的ROCK通路蛋白的表达水平明显降低。免疫荧光染色发现,CXCR7稳定沉默后细胞F-actin明显呈现出紊乱的解聚状态。同样,用mTOR抑制剂雷帕霉素和Torin1处理细胞之后,F-actin亦明显呈现出紊乱的解聚状态。51在胰腺癌裸鼠原位移植瘤模型中,CXCR7稳定沉默或过表达细胞株原位肿瘤的增殖与对照组相比没有明显差异。CXCR7稳定沉默细胞肝转移灶与较对照组相比明显减少(p<0.05),CXCR7稳定过表达细胞肝转移灶较对照组相比显著增多(p<0.05)。6)对人胰腺癌组织标本的免疫组化研究发现,CXCL12和CXCR7在胰腺癌组织的表达水均显著高于癌旁组织(p<0.05),且CXCL12和CXCR7在胰腺癌组织中的表达水平与神经浸润呈正相关(p<0.05)。单因素生存分析显示,性别、肿瘤分化程度、淋巴结转移、CXCL12和CXCR7的表达与预后有相关性(p<0.05),Cox回归显示男性、低分化肿瘤、淋巴结转移、CXCL12和CXCR7共同高表达是患者不良预后的独立危险因素(p<0.05)。研究结论1)CXCL12-CXCR7轴对胰腺癌细胞增殖没有明显影响,但是显著加速细胞迁移和侵袭。2)CXCL12-CXCR7轴可通过激活mTOR通路增加肿瘤细胞的迁移和侵袭,而这是通过CXCR7直接和mTOR的直接相互作用进而通过ROCK通路影响细胞的运动能力来实现的。3)CXCR7可促进裸鼠胰腺原位移植瘤肝转移,但对于原位肿瘤的生长没有明显影响。4)CXCL12和CXCR7在胰腺癌组织中高表达,二者共同高表达是胰腺癌患者预后的独立危险因素。
【作者】李建；
【导师】张太平；
【作者基本信息】北京协和医学院，普通外科学，2014，博士
【关键词】胰腺癌；CXCL12；CXCR7；迁移；侵袭；预后；

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