蛋白酶抑制剂OVOS2及TIMP-4与皮肤恶性黑素瘤发病机制的相关性研究

【摘要】皮肤恶性黑素瘤(cutaneousmalignantmelanoma,CMM)是皮肤科致死率最高的恶性肿瘤,具有进展快、易转移、放化疗不敏感等特点。目前黑素瘤发生的分子机制尚不完全清楚。蛋白酶抑制剂是一种多功能蛋白质肽分子,因其在多种肿瘤中表达异常,并呈现促进和抑制的双向调节作用,成为肿瘤研究的热点之一。本研究首次探讨两种蛋白酶抑制剂卵固蛋白2(Ovostatin2,OVOS2)和组织型基质金属蛋白酶抑制剂4(tissueinhibitorofmetallopmteinase-4,TIMP-4)在黑素瘤发生发展中的作用。一、蛋白酶抑制剂OVOS2与皮肤恶性黑素瘤发病机制的相关性研究1.蛋白酶抑制剂OVOS2在恶性黑素瘤组织和细胞中的表达及意义我们前期采用一款全新的全基因组表达谱芯片,发现OVOS2在中国人肢端黑素瘤中呈明显的高表达,为验证基因芯片结果,探讨蛋白酶抑制剂OVOS2表达是否与皮肤黑素瘤的发生发展过程相关,我们通过real-timePCR、Westernblot分析,发现CMM组织中OVOS2mRNA和蛋白水平较瘤旁组织明显上调；与正常人黑素细胞相比,黑素瘤细胞株中OVOS2mRNA和蛋白表达也明显上调,以在A375细胞中上调最为明显。为进一步探讨OVOS2表达与黑素瘤发生发展的相关性,我们进一步通过免疫组化方法检测OVOS2在114例CMM及良性痣组织中的表达,并分析其与临床病理特征及预后指标的关系。结果再次证实OVOS2在CMM中表达增加,其表达水平与黑素瘤恶性程度指标如Breslow厚度、Clark分级、临床分期、KI指数及VEGF表达呈正相关。可见,OVOS2在恶性黑素瘤细胞及组织中均呈现异常高表达,其表达水平与CMM的恶性程度密切相关。2.VshRNA-OVOS2重组质粒及稳定转染细胞株的构建前文实验结果表明A375细胞株中OVOS2上调最为明显,我们将A375细胞作为研究对象,首先设计4个OVOS2-shRNA片段,并载入pGMLV-SB1RNAi,构建慢病毒干扰载体(VshRNA-OVOS2),包装病毒并感染A375细胞,采用Real-timeRT-PCR和Westernblot筛选出沉默效果最好的靶细胞,并命名为A375/OVOS2-shRNA,同时将阴性对照慢病毒载体感染A375细胞作为对照组(negativecontrol,NC),命名为A375/NC-shRNA。最后经细胞免疫化学法证实,A375/OVOS2-shRNA中OVOS2表达明显受抑制,所获得的稳定转染细胞株,用于后续实验。3.蛋白酶抑制剂OVOS2对A375细胞生物学行为的影响及机制研究为探讨OVOS2对人黑素瘤细胞株A375生物学行为的影响及其可能机制,我们采用直接细胞计数法、MTT法及克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞技术检测细胞凋亡及细胞周期变化,细胞划痕实验及Transwell小室实验检测细胞运动及侵袭能力,裸鼠皮下成瘤实验评估细胞体内致瘤能力,观察未处理A375细胞、A375/OVOS2-shRNA及A375/NC-shRNA三组细胞的体内外生物学行为改变；进一步通过Westernblot方法检测细胞中p-FAK、p-AKT、p-ERK、MMP-2、E-cadherin、N-cadherin和β-catenin以及细胞周期相关蛋白表达情况,分析OVOS2影响黑素瘤细胞生物学行为的可能机制。结果表明,干扰OVOS2表达能够有效抑制黑素瘤细胞A375的体内外增殖活性、导致细胞周期发生G2/M阻滞,但对细胞凋亡促进作用不显著。OVOS2可能通过过度激活FAK/MAPK/ERK和FAK/PI3K/AKT信号通路,对细胞周期和细胞增殖进行调控。沉默OVOS2表达后,细胞的迁移和运动能力显著下降,细胞中上皮表型蛋白E-cadherin,β-catenin表达增加,而间质表型蛋白N-cadherin表达降低。OVOS2可能参与黑素瘤细胞的上皮间质转化,影响肿瘤细胞的迁移和运动能力。二、蛋白酶抑制剂TIMP-4在恶性黑素瘤组织和细胞中的表达及意义通过Westernblot分析,我们发现TIMP-4蛋白水平在CMM组织中较瘤旁组织和良性痣组织明显上调；黑素瘤细胞株中TIMP-4表达较正常人黑素细胞也明显上调。为进一步探讨TIMP-4表达与黑素瘤发生侵袭的相关性,我们通过免疫组化方法检测TIMP-4在94例CMM及良性痣组织中的表达,分析其与CMM临床病理特征和预后指标的相关性。结果进一步证实TIMP-4在CMM中表达升高,其表达水平与黑素瘤恶性程度及MMP-2和VEGF表达相关。TIMP-4表达可能参与CMM的恶性进程,尤其与肿瘤转移倾向及血管生成关系密切。结论在恶性黑素瘤细胞及组织中,蛋白酶抑制剂OVOS2和TIMP-4表达均明显上调,且二者的高表达均与黑素瘤的恶性程度相关。体内外实验表明阻断OVOS2表达可明显降低黑素瘤细胞A375的增殖活性及迁移运动能力,影响细胞周期进程,OVOS2对肿瘤的正向调控作用可能与其过度激活FAK/MAPK/ERK和FAK/PI3K/AKT信号通路,促进上皮间质转化过程有关。可见,蛋白酶抑制剂OVOS2和TIMP-4与恶性黑素瘤的发生发展关系密切,OVOS2可能在促进黑素瘤细胞的增殖和迁移运动过程中起到重要作用,而TIMP-4表达上调则反映肿瘤转移倾向及血管生成潜能。这些研究结果为恶性黑素瘤的诊断和治疗提供了新的研究方向和思路,充实了蛋白酶抑制剂与黑素瘤发生的相关理论,为进一步研究它们的确切作用及分子机制提供了大量的理论基础和实验依据。
【作者】黄莹雪；
【导师】孙建方；
【作者基本信息】北京协和医学院，皮肤病与性病学，2014，博士
【关键词】恶性黑素瘤；蛋白酶抑制剂；细胞周期；信号通路；上皮间质转化；

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