中波紫外线对角质形成细胞自噬和氧化应激影响的初步研究

【摘要】自噬是真核细胞的一种具有自我保护功能的生理现象,主要帮助细胞适应各种不良刺激,是细胞维持内环境的自稳并且实现自我更新的基本途径。紫外线辐射可以使皮肤角质形成细胞产生活性氧片段(Reactiveoxygenspecies,ROS),进一步使组织和细胞发生脂质过氧化以及DNA的损害。本课题研究了中波紫外线(Ultraviolet-B,UVB)对人皮肤角质形成细胞(Keratinocyte,KC)产生的自噬和氧化应激现象,并引入抗氧化剂,初步探讨自噬和氧化应激相关的可能的信号通路,为将来深入发掘白噬和氧化应激之间相互调控的分子机制,以及在疾病发生中的作用奠定实验基础。本研究第一部分首先对比了不同剂量的UVB和不同浓度的过氧化氢(H2O2)刺激对角质形成细胞系HaCaT细胞和人原代KC增殖活力的影响,确定合适的UVB剂量和H2O2作用浓度；第二部分对比了相同UVB辐照后以上两种细胞自噬囊泡表达水平上的差异；第三部分检测了UVB照射后原代KC氧化应激水平的变化,以外源性H2O2孵育为阳性对照,并引入抗氧化剂α-硫辛酸(alfa-lipoicacid,LA),了解其是否能够改变UVB辐照相关的氧化压力；第四部分检测了UVB照射以及UVB照射+LA处理后原代KC自噬表达水平的变化。本课题研究目的：1.了解两种角质形成细胞对紫外线辐射和外源性H2O2刺激耐受程度。2.对比UVB辐射后两种角质形成细胞自噬囊泡表达水平的差异。3.抗氧化剂干预是否改变UVB造成的原代KC氧化应激水平和自噬水平,分析自噬与氧化压力水平的相关性及可能的分子机制。研究方法：1.建立UVB辐射和外源性H2O2相关的氧化应激模型,倒置显微镜下观察UVB和H2O2刺激后细胞形态和显微结构的变化,并用MTT法检测UVB、H2O2对细胞增殖活力的影响。2.采用MDC染色法对自噬体和晚期自噬囊泡进行染色,运用倒置荧光显微镜在UVB辐照和(或)抗氧化剂孵育后相应的时间点对染色后的细胞进行摄片,统计每个视野自噬囊泡表达阳性的百分比。3.运用化学法检测细胞内脂质过氧化物MDA和总抗氧化能力TAOC。4.2’7’-二氯荧光乙酰乙酸钠(DCFH-DA)荧光探针对细胞内ROS进行染色,倒置荧光显微镜下观察荧光强度的变化,并用流式细胞术对绿色荧光进行定量。采用免疫印迹法检测自噬自噬相关蛋白磷酸化mTOR、LC3、p62,对自噬表达水平进行半定量分析。研究结果：1.UVB和H202对原代KC、HaCaT细胞形态和增殖活力的损伤成剂量相关性,原代角质形成细胞更耐受UVB和H2O2的损伤。2.MDC染色法表明相同剂量的UVB照射对原代KC和HaCaT细胞自噬水平产生不同的结果,5、10、20mJ/cm2UVB照射能促进HaCaT细胞自噬囊泡的表达水平增加,且有剂量依赖性,而对原代角质形成细胞自噬囊泡表达水平未产生显著影响；40mJ/cm2UVB照射后HaCaT细胞自噬囊泡表达水平高于未照射组但较20mJ/cm2组低,而40mJ/cm2UVB照射显著抑制原代KC自噬水平的表达。3.10mM的H2O2和40mJ/cm2的UVB均能显著诱导角质形成细胞ROS和MDA的生成,且照射后4h细胞内ROS、MDA水平较照射后12h为高,照射后12hROS、MDA水平基本恢复正常；加抗氧化剂LA孵育后能减轻照射后4h的ROS、MDA水平。4.MDC染色显示UVB照射+LA孵育4h或12h原代KC自噬囊泡表达阳性的细胞比例较单纯UVB照射组增加,以UVB照射+LA孵育12h者增加更为显著；单纯UVB照射后12h细胞自噬囊泡表达阳性的细胞比例及LC3水平较照射后4h上调。5.LA和H202均有诱导原代KC自噬囊泡形成及LC3水平上调的作用,免疫印迹法检测磷酸化mTOR和p62均未显示明显差异。结论：1.HaCaT细胞和原代KC对相同UVB辐射体现了不一致的增殖抑制效应和自噬表达结果,原代KC更耐受UVB的辐射损伤,UVB照射抑制了原代角质形成细胞自噬囊泡的形成。2.UVB辐射和外源性H202孵育均能够使原代KC氧化应激压力增加,照射后随着时间推移细胞有自行修复的能力,表现为ROS和MDA水平恢复正常,及UVB对自噬的抑制效应减轻。3.LA能够减轻UVB照射相关的氧化应激损伤,并且能够减轻UVB照射导致的自噬抑制现象,LA的保护作用可能通过诱导自噬上调来实现。4.抗氧化剂LA和促氧化剂H202上调LC3的表达均通过非mTOR途径实现,p62可能没有参与两者相关的自噬调控。
【作者】黄丹；
【导师】顾恒；
【作者基本信息】北京协和医学院，皮肤病与性病学，2014，博士
【关键词】紫外线；角质形成细胞；自噬；氧化应激；α-硫辛酸；

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