镉对大鼠成骨细胞的毒性机理及NAC的保护效应

【摘要】重金属镉存在广泛、半衰期长、危害严重,可在人体长期蓄积,损伤神经系统、侵害心血管系统、抑制免疫功能、影响内分泌系统、具有生殖毒性、对骨骼系统更深具影响,其骨骼毒性作用机理亟待进一步深入研究和解析。体内外研究证实,镉可引起多种细胞损伤和凋亡,且凋亡与氧化应激、胞内钙稳态、线粒体损伤、促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)及非Caspase依赖性通路的激活密切相关。本研究以体外培养的孕18dSD大鼠胎鼠成骨细胞为模型,通过体外试验探讨了镉对大鼠成骨细胞的毒性损伤效应及其凋亡可能的作用机理,为进一步认识镉的骨骼毒性作用提供依据。1.镉对大鼠成骨细胞的毒性损伤及NAC的保护效应采用二次酶消化法获得孕18dSD大鼠胎鼠成骨细胞,经鉴定后,用0、0.125、0.25、0.5、1、2、5、10、20μmol/L的醋酸镉染毒,通过cck-8还原法和细胞实时监控测定0-48h内染镉细胞存活率、细胞指数及LDH酶活性；染毒时加入0、100、500μmol/L、1、2mmol/LNAC,研究镉对大鼠成骨细胞的毒性损伤及NAC的保护作用,同时筛选作用浓度。结果表明,随着染镉浓度的增大,成骨细胞的存活率逐渐减少,呈剂量效应关系,且具有差异显著性(P<0.05、P<0.01);LDH活性显著或极显著升高(P<0.05、P<0.01);NAC可以显著提高细胞存活率、降低LDH释放率(P<0.05、P<0.01)。表明NAC对镉致成骨细胞毒性损伤具有一定保护作用。2.镉对大鼠成骨细胞形态结构和凋亡的影响及NAC的保护效应染镉后细胞形态结构的变化直观反映其损伤程度,直接影响其功能。用筛选出的作用浓度,即0、1、2、5μmol/L醋酸镉(?)500μmol/LNAC作用于成骨细胞。使用光学显微镜、荧光染色、透射电镜观察不同浓度镉及NAC对成骨细胞形态、细胞核形态及超微结构的影响,并用流式细胞仪检测细胞凋亡率,为进一步探讨镉损伤成骨细胞结构和功能的作用机理提供理论依据。结果表明,镉暴露导致大鼠成骨细胞及细胞核形态改变,线粒体损伤,出现典型凋亡特征,细胞凋亡率随染毒剂量增大而升高,呈剂量效应关系。NAC能有效缓解镉引起的细胞、细胞核及线粒体形态结构损伤,但凋亡率与染毒组无显著差异。3.镉致大鼠成骨细胞氧化损伤及NAC的保护效应在镉诱导的毒性损伤中,氧化应激起着重要作用。用0、1、2、5μmol/L醋酸镉和500μmol/LNAC作用于成骨细胞。采用黄嘌呤氧化酶比色法,DTNB比色法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性及谷胱甘肽(GSH)含量；用荧光染料DCFH-DA、罗丹明123检测细胞内活性氧水平和线粒体膜电位的变化,研究了镉对大鼠成骨细胞的氧化损伤及NAC的作用。结果表明,SOD活性极显著升高(P<0.01);GR活性在1μmol/L镉作用24h时显著升高(P<0.05),随后急剧降低(P<0.01);GSH含量极显著升高(P<0.01),ROS、ΔΨm水平极显著降低(P<0.01)。表明0-5μmol/L镉触发了体内抗氧化系统,机体依赖酶性和非酶性抗氧化物形成有效保护机制,清除镉暴露所产生的ROS,缓解低浓度镉对成骨细胞造成的氧化损伤。与单独染镉组比较,NAC极显著降低SOD活性(P<0.01)、极显著缓解了GR降低趋势(P<0.01)、极显著提高GSH含量(P<0.01)、极显著缓解了ROS降低趋势(P<0.01),表明其对镉致大鼠成骨细胞氧化损伤具有一定的保护作用。4.Caspase途径在镉致大鼠成骨细胞凋亡中的作用在细胞凋亡信号传递中,半胱氨酸蛋白酶(Caspase)是凋亡的重要起始者和执行者。本研究用分光光度法检测Caspase活性、用Caspases广谱抑制剂Z-VAD-fmk进行Caspase的阻断和抑制实验,研究镉致成骨细胞凋亡过程中是否启动Caspase依赖性信号通路,为揭示Caspase途径在镉致大鼠成骨细胞凋亡中的分子机制提供依据。结果表明,在1、2、5μmol/L醋酸镉作用下,Caspase-3活性显著或极显著升高(p<0.05、p<0.01);Z-VAD-fink对镉引起的细胞成活率无显著提高作用(P>0.05),且对细胞凋亡形态和数量也无显著影响,说明在镉致成骨细胞凋亡的过程中,Caspase途径被激活,同时很可能启动了非Caspase途径。5.钙离子途径在镉致大鼠成骨细胞凋亡中的作用钙稳态失衡是细胞凋亡中的普遍现象。本研究在进行成骨细胞染镉的同时添加钙离子抑制剂Bapta-AM,通过观察细胞与细胞核形态变化、测定细胞内钙离子浓度、细胞存活率、细胞活性氧水平和线粒体膜电位,流式细胞仪测定凋亡率,探讨钙稳态失衡对镉引起成骨细胞凋亡的影响。结果显示,镉可致成骨细胞内钙离子浓度极显著升高(P<0.01),而Bapta-AM能缓解染镉细胞及细胞核形态变化,抑制镉引起的钙离子浓度的升高,极显著提高染镉细胞存活率、ROS水平和线粒体膜电位(P<0.01),降低细胞凋亡率,从而在一定程度上阻断凋亡过程,证实Ca2+超载是引起成骨细胞凋亡的重要原因。6.MAPK途径在镉致大鼠成骨细胞凋亡中的作用丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是介导胞外刺激到胞内反应的重要信号转导系统,通过转录因子磷酸化而改变基因的表达水平,参与细胞凋亡、增殖等多种过程。本研究在染镉成骨细胞中添加MAPK各通路关键蛋白抑制剂SB202190、SP600125和U0126,通过免疫印迹测定其磷酸化情况,探讨MAPK途径在镉致大鼠成骨细胞凋亡中的作用。结果显示,镉可致ERK、p38MAPK磷酸化水平升高,JNK磷酸化水平降低；p38和ERK的抑制剂都能有效的阻止镉引起的p-p38和p-ERK表达升高,而JNK的抑制剂不能抑制镉引起的p-JNK表达的降低。说明镉可激活大鼠成骨细胞MAPK信号通路,其中ERK、p38MAPK可能发挥促进凋亡的作用,而JNK发挥相反作用。7.镉对大鼠成骨细胞RANKL/OPG的影响RANKL/RANK/OPG系统是骨代谢过程中的一个重要信号传导通路。多数因子和激素通过调节RANKL/OPG控制骨形成与骨吸收。本研究通过免疫印迹法测定了0-5μmol/L镉对成骨细胞OPG.RANKL蛋白表达水平的影响,探讨其在骨代谢过程中的作用。结果表明,镉可致大鼠胎鼠成骨细胞RANKL/OPG比值降低,提示镉可通过阻断RANK与RANKL结合来抑制破骨细胞的分化,从而抑制大鼠胎鼠的骨吸收作用。
【作者】王怡；
【导师】刘宗平；
【作者基本信息】扬州大学，临床兽医学，2014，博士
【关键词】大鼠；成骨细胞；镉；毒性；凋亡；NAC；

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