毒害艾美耳球虫配子体抗原基因的克隆表达与功能研究

【摘要】鸡球虫病是由一种或数种艾美耳球虫寄生于鸡消化道上皮细胞内而引起的一种寄生原虫虫病,严重危害养鸡业,在我国每年仅用于该病的防治费用就达3-6亿元。寄生于鸡的球虫有7种,其中柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)和毒害艾美耳球虫(E.necatrix)的致病性最强,分别引起急性盲肠球虫病和急性小肠球虫病。毒害艾美耳球虫主要危害8-18周龄的鸡。我国在上世纪饲养的肉仔鸡多数为白羽肉鸡如AA肉鸡,其饲养周期短,而饲养周期长的鸡一般为种鸡或蛋鸡,其后期的饲养方式常为笼养,因此在临床上由毒害艾美耳球虫引起的急性小肠球虫病较少见。近年来,随着人们对鸡肉风味的特殊要求,广泛饲养的黄羽肉鸡饲养周期相对较长,在“公司+农户”养殖模式下的饲养方式多数为地面放养、地面及网上平养等,因而由毒害艾美耳球虫引起的急性小肠球虫病越来越多见,且与产气荚膜梭菌、大肠杆菌等致病菌混合感染,造成更大的经济损失。长期以来,鸡球虫病的防治主要依赖药物,但是由于耐药性虫株、药物残留肉蛋、病原污染环境等人类比较关注的问题,欧盟逐渐减少了市场准入的抗球虫药种类,并在2012年开始全面禁止将抗球虫药用作饲料添加剂。美国食品及药物管理局(FDA)也提出了相似的抗球虫药物使用禁令(FDA-2011-D-0784)。这使得球虫病的防治方法由化学预防转向免疫预防。目前临床上使用的鸡球虫病疫苗主要两大类,一是由数种鸡球虫卵囊组成的活虫苗,二是由3种巨型艾美耳球虫(E.maxima)配子体抗原组成的亚单位疫苗。配子体抗原是卵囊壁蛋白的前体蛋白,位于球虫大配子体的成壁体上。迄今为止,在艾美耳球虫中只有少数的配子体抗原基因被克隆,主要有巨型艾美耳球虫的Emgam56,Emgam82和Emgam230(部分序列),柔嫩艾美耳球虫的Etgam56(Etgam56tmp1),Etgam59(Etgam56tmp2)和Etgam22,以及堆型艾美耳球虫(E.acervulina)的Eagam56(部分序列)。有关毒害艾美耳球虫配子体抗原基因及其体外重组表达与功能研究尚无见有报道,为此本文开展了下列研究工作,旨为研制鸡球虫病亚单位疫苗及探明毒害艾美耳球虫卵囊壁形成的分子基础与机制奠定基础。首先,提取毒害艾美耳球虫配子体总RNA,应用RT-PCR获取Engam22基因序列,并克隆到T载体中进行测序和序列分析。Engam22基因全长为713bp,含有一个完整的开放阅读框,大小为561bp,编码186个氨基酸,具有一个富含组氨酸和脯氨酸的特征性结构域；与柔嫩艾美耳球虫Etgam22基因序列进行比对,同源性为97.7%。以构建的pGEM-T-Engam22为模板,设计特异性引物去除信号肽后,扩增得到一个522bp片段,将此基因插入到原核表达载体pET28a(+)上,在EscherichiacoliBL21中成功表达。融合蛋白大小在29kDa左右,主要以包涵体的形式存在。Westernblot结果显示,重组蛋白rEnGAM22能识别抗6×HIS标签单抗和鼠抗rEnGAM22多抗,也能被毒害、柔嫩和巨型艾美耳球虫的康复血清识别。免疫组化分析结果显示,Engam22基因表达产物定位在成壁体、卵囊壁和孢子囊壁,不见于第二代裂殖体。荧光定量PCR结果显示,Engam22基因在不同发育阶段的表达情况与荧光定位结果相一致,表明Engam22基因在第二代裂殖体或裂殖子阶段不转录,在配子体发育阶段转录并表达,其表达产物参与卵囊壁的形成。随后,用相同的方法通过RT-PCR扩增获得毒害艾美耳球虫Engam59和Engam56基因,并对两者的序列测序和序列分析。结果显示,Engam59基因全长为1473bp,其中包含一个完整的开放阅读框,大小为1473bp,编码490个氨基酸,含有一个富含酪氨酸和丝氨酸的特殊性结构域,与柔嫩艾美耳球虫Etgam59基因的同源性为93.4%,与巨型艾美耳球虫Emgam56基因的同源性为61.4%。Engam56基因全长为918bp,含有一个富含酪氨酸和丝氨酸的特殊性结构域,与Emgam56的同源性为73.2%,与Engam59同源性为63.2%,与Etgam59的特异性为60.9%。选取Engam59和Engam56基因中免疫原性较强的片段,设计特异性引物,扩增得到产物分别为687bp和522bp,分别构建原核表达质粒pET28a(+)-Engam59和pET28a(+)-Engam56,成功诱导表达。融合蛋白大小分别约为28kDa(rEnGAM59)和24kDa(rEnGAM56),主要以包涵体的形式存在。重组蛋白均能识别抗6×HIS标签单抗,并能分别识别鼠抗anti-rEnGAM59多抗和鼠抗anti-rEnGAM56多抗,也均能与毒害艾美耳球虫康复血清发生特异性反应。免疫组化分析结果显示,Engam59和Engam56基因表达产物主要存在于成壁体与卵囊壁,表明两者表达的产物参与卵囊壁的形成。最后,将纯化复性的重组蛋白rEnGAM22按不同剂量免疫无球虫感染雏鸡,免疫2次后除非免疫非攻虫组外,其余各试验组雏鸡均感染毒害艾美耳球虫孢子化卵囊,以卵囊减少率、病变记分、平均增重等为指标,评价重组蛋白的免疫保护效果,并检测其诱导的特异性免疫应答水平。试验共进行2次。结果显示,rEnGAM22以每鸡50μg的免疫剂量保护效果最好；与未免疫攻虫组相比,重组蛋白rEnGAM22能降低卵囊产量与病变记分,提高平均增重：能诱导机体产生较高水平的细胞免疫和体液免疫。
【作者】刘丹丹；
【导师】陶建平；
【作者基本信息】扬州大学，预防兽医学，2014，博士
【关键词】毒害艾美耳球虫；配子体抗原；基因；克隆；表达；功能研究；

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