一氧化氮抑制猪圆环病毒复制的体内外研究

【摘要】猪圆环病毒(porcinecircovirus,PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属,有PCV1和PCV2两种基因型,PCV1无致病性,PCV2是断奶仔猪多系统衰竭(post-weaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)主要病原,也是目前养猪业危害最大的病原之一,对世界养猪业造成严重影响并且产生巨大的经济损失。除PMWS外,PCV2还可引起猪皮炎肾病综合征(porcinedermatitisandnephropathysyndrome,PDNS)、猪呼吸系统疾病综合征(porcinerespiratorydiseasecomplex,PRDC)、繁殖障碍(reproductivefailure).肉芽肿性肠炎(granulomatousenteritis)、渗出性表皮炎(exudativeepidermitis)、坏死性淋巴结炎(necrotizinglymphadenitis)、先天性震颤(Congenitaltremor,CT)等圆环病毒病(porcinecircovirusdisease,PCVD),或称之为圆环病毒相关疾病(porcinecircovirusassociateddisease,PCVAD)。PCV2既可以水平传播,也可以垂直传播,通过粪便、尿液、乳汁、血清和精液等多种方式排毒,还可与其他细菌、病毒及寄生虫等混合感染,防控难度极大。目前,PCV2致病机理仍不明确,也没有针对该病毒的特效药,猪场主要依靠疫苗预防PCVAD的爆发,但是受到多种因素影响,PCV2疫苗的保护效力也经常不尽人意。一氧化氮(NO)作为一种重要的信号分子,具有复杂多样的病理、生理作用,它能抵抗或杀灭多种病原微生物,包括细菌、寄生虫、真菌和蠕虫等,还能抑制多种DNA、RNA病毒复制和感染,而NO对PCV2复制的影响鲜有报道,本研究通过体内外试验证实NO具有抑制PCV2复制的活性,并探寻该抑制效应的潜在机理,旨在揭示PCV2部分致病机制以及为防控PCVAD提供新的思路。1、NO经NF-κB通路抑制PCV2的体外复制本研究为了探讨NO对猪圆环病毒(PCV2)在Dulac细胞上复制的影响。S-亚硝基乙酰青霉胺(SNAP)用作外源性NO供体,同时将结构类似物但是非NO供体乙酰青霉胺(NAP)用作药物对照。SNAP(50、100、200μM)、NAP(200μM)处理细胞6小时后接种PCV2,继续培养72小时,不接种病毒且不用药物处理的细胞设为阴性对照。通过测定细胞培养上清中NO水平、PCV2感染细胞比例、病毒效价和病毒DNA拷贝数,评价NO对PCV2复制的影响；此外,将pNF-KB-luc报告基因转染到Dulac细胞内,通过检测萤光素酶活性来探讨NO影响PCV2复制的机理是否与NF-κB通路有关。结果显示,NO产生量与SNAP的浓度存在剂量依赖性,NO抑制PCV2的复制并呈剂量依赖效应,此外,不论Dulac细胞是否感染PCV2,NO均能显著抑制NF-κB活性且表现出剂量依赖效应。由此可见,外源性NO通过下调NF-κB的活性抑制PCV2的体外复制。2、NO体外抑制PCV2复制的实现形式为NO·本文旨在探讨NO自由基(NO·)对PCV2复制的抑制作用。我们采用两种NO供体：SNP和抗坏血酸(Vc)在培养基中联合产生NO·,而SNP独自产生NO的主要形式为NO+。PCV2感染的Dulac细胞分别用以上两种形式的NO供体处理,结果显示,NO产生量与这两种供体均表现出剂量依赖效应,SNP+Vc处理组病毒效价与PCV2感染对照组比较,差异极显著(P<0.01),PCV2感染细胞的比例和病毒DNA拷贝数也显著低于PCV2感染对照组(P<0.05),而SNP和Vc单独处理细胞均不影响PCV2的复制。由此可见,SNP和Vc联合产生的NO·对PCV2有显著的抑制作用,SNP产生的NO+并没有抗PCV2活性。因此,NO体外抗PCV2活性主要是通过NO·实现的,与NO+无关。3、外源性NO和内源性NO对PCV2体外复制的影响比较本文旨在探讨外源性NO和内源性NO对PCV2在Dualc细胞内复制的影响。为此,我们采用亚硝基谷胱甘肽(nitrosoglutathione,GSNO)作为外源性NO供体,L-精氨酸(L-arginine)提供内源性NO,L-精氨酸代谢产物瓜氨酸(citrulline)用作药物对照,通过测定NO产生动力学、PCV2感染细胞比例、病毒效价和病毒DNA拷贝数比较二者对PCV2复制的影响。结果显示,与对照组比较,GSNO处理组NO水平呈显著增加(P<0.01),72小时达到峰值,NO水平与GSNO呈现剂量依赖性,L-精氨酸和瓜氨酸处理Dulac细胞均不产生NO；药物处理Dulac细胞后,与感染对照组比较,L-精氨酸和瓜氨酸处理组病毒效价、相对感染细胞和病毒DNA拷贝数均无显著变化P>0.05),而GSNO处理组病毒效价显著低于感染对照组(P<0.05),PCV2感染细胞比例和病毒DNA拷贝数也低于感染对照组并且呈极显著差异(P<0.01)。由此可见,由GSNO产生的外源性NO对PCV2复制呈显著抑制效应,而L-精氨酸处理Dualc细胞不能产生内源性NO,因而不能抑制PCV2复制。4、血红蛋白对NO体外抑制PCV2复制的影响GSNO产生的外源性NO对PCV2体外复制的抑制作用已在第三章的研究中得到证实,本研究用GSNO和NO清除剂血红蛋白(Hb)联合处理Dulac细胞,旨在探讨外源性NO被Hb处理后,其抗PCV2活性是否受到影响。结果显示,各处理组NO水平随Hb浓度升高而降低,表现出一定的剂量依赖性,Hb与GSNO联合处理组NO水平均低于GSNO单独处理组；与GSNO单独处理组比较,Hb与GSNO联合处理组的PCV2感染细胞比例、病毒效价和病毒DNA拷贝数均有不同程度升高,且与Hb呈现剂量依赖效应,20μMHb与GSNO联合处理组各指标与感染对照组无显著差异(P>0.05)。由此可见,Hb可以有效清除GSNO产生的NO,NO体外抑制PCV2复制的作用可以被清除剂Hb阻断,这也是NO体外抗PCV2活性的另一佐证。5、外源性NO抑制PCV2在BALB/c小鼠体内复制本研究采用BALB/c小鼠人工感染PCV2,同时腹腔注射外源性NO供体GSNO,测定小鼠平均日增重、免疫器官指数、组织和血清样品PCV2阳性比例和血清中PCV2DNA拷贝数以及血清中PCV2特异性抗体水平,以此评价NO对BALB/c小鼠感染PCV2的影响。结果显示,与PCV2感染对照组比较,GSNO处理组小鼠平均日增重、免疫脏器指数均有不同程度的升高；组织和血清样品PCV2阳性比例和血清中PCV2DNA拷贝数呈现下降趋势；不论GSNO处理与否,PCV2感染小鼠的血清中几乎检测不到该病毒的特异性抗体(荧光抗体)。由此可见,GSNO释放的外源性NO对PCV2在BALB/c小鼠体内的复制表现出显著的抑制效应,但是未改变小鼠血清中的PCV2抗体水平。
【作者】刘传敏；
【导师】高崧；
【作者基本信息】扬州大学，预防兽医学，2014，博士
【关键词】猪圆环病毒；PCV2复制；一氧化氮；一氧化氮供体；

【参考文献】
[1]刘波.轨道交通车辆座椅的静强度和疲劳强度分析[D].吉林大学,设计艺术学,2004,硕士.
[2]张维.三氯生在石墨烯修饰电极上的电化学行为及其测定[J].福建分析测试,2012,06:5-8.
[3]曹叠峰.各国语言推广机构运营模式和决策机制的比较分析[J].湖南师范大学社会科学学报,2014,01:141-147.
[4]王立红.益气养阴活血方对糖尿病大鼠血清内皮脂肪酶EL水平的影响[D].河北医科大学,中医内科学,2014,硕士.
[5]赵宇飞.河南省农业产业结构调整对其经济增长的影响研究[D].西安科技大学,产业经济学,2013,硕士.
[6]宁腾飞.遗嘱信托的民法思考[D].中国政法大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[7]尹超.纳米多孔二氧化钛材料在光电解水制氢中的应用研究[D].黑龙江大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[8]顿楠.内蒙古能源消费结构研究[D].内蒙古大学,中国少数民族经济,2014,硕士.
[9]谢天罡,江明菲,董逸生.一个开放的OLAP体系结构[J].小型微型计算机系统,2002,01:66-69.
[10]卢青.区域公路交通经济适应性研究[D].西南交通大学,交通运输工程,2014,硕士.
[11]李定泽.轮胎模具加工的刀具消耗量预测及系统实现[D].广东工业大学,机械电子工程,2013,硕士.
[12]李云典,孙成禹,曲良河,吕功训,王宁.τ-p域AVO分析[J].石油地球物理勘探,1994,04:413-422+534.
[13]郭东浦,李志军.尼尔基水利枢纽建设的必要性[J].水利规划设计.2000(01)
[14]陈柏文.足尺寸建筑模式下植被屋面的隔热性能及能耗特性研究[D].广东工业大学,建筑与土木工程,2014,硕士.
[15]李超群,李映虎,廖双泉,廖小雪.乳液法制备天然橡胶/丁苯橡胶/石墨烯纳米复合材料及性能研究[J].广东化工,2013,18:18-19.
[16]祝军军.ABS仿真台的研究与开发[D].燕山大学,车辆工程,2014,硕士.
[17]吴海忠.城市消化污泥脱水性能及资源化研究[D].北京建筑大学,环境工程,2013,硕士.
[18]安健.全国冶金自动化信息网西南分网年会在昆明召开[J].冶金自动化,2006,02:64.
[19]胡志刚.初中历史教学的现状、问题及对策研究[D].华中师范大学,教育,2013,硕士.
[20]黄永生.船体型线数字化及型线自动生成研究[D].武汉理工大学,船舶与海洋结构物设计制造,2004,硕士.
[21]夏勇.宁夏地方法人银行经济资本管理研究[D].宁夏大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[22]张小勇.电厂热工过程自适应前馈控制系统设计[D].华北电力大学（河北）,热能工程,2004,硕士.
[23]张红娟.三氧化二砷联合吉西他滨对EL-4细胞作用及其机制研究[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[24]张会会.跨国供应链数量折扣和退货的组合契约研究[D].西南交通大学,管理科学与工程,2012,硕士.
[25]张鹏,齐文娟,邓自立.分簇传感网络系统两级鲁棒观测融合Kalman滤波器（英文）[J].自动化学报,2014,11:2585-2594.
[26]张军峰,胡寿松.基于一类局部固定核的支持向量回归建模[J].控制与决策,2008,06:660-664.
[27]徐惠娟.副猪嗜血杆菌病灭活疫苗菌株的筛选[D].河南科技大学,兽医（专业学位）,2013,硕士.
[28]单伟光,陶蓉,宋必卫.α-倒稔子素亚微乳在大鼠体内的药动学及血浆蛋白结合率研究[J].浙江工业大学学报,2013,03:237-240.
[29]任玮.M集团绩效考核与薪酬体系研究[D].内蒙古大学,高级管理人员工商管理,2013,硕士.
[30]程君.多集群环境下MPI群集通信算法的研究[D].吉林大学,计算机系统结构,2013,硕士.
[31]关瑜.重组人胶原蛋白高效表达菌株筛选及抗氧化性活性研究[D].吉林农业大学,生物物理学,2012,硕士.
[32]陈俊儒.数据安全的Zigbee-以太网瘦网关设计[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[33]吕敏.双层石墨烯的电和磁响应[D].中国科学技术大学,2011.
[34]解飞,张莹,金伟,潘婷婷,周超,任昊,金钦汉,牟颖.基于表面等离子体子共振成像技术研究苏拉明和顺铂对肝癌细胞生长的抑制作用[J].高等学校化学学报,2014,01:30-36.
[35]宋鸽.海岛型红树林保护区社区居民旅游感知研究[D].中南林业科技大学,森林游憩与公园管理,2013,硕士.
[36]胡际平.现代地下采矿方法典型实例(四)——分段空场采矿法[J].国外金属矿山.1990(05)
[37]刘建.骨髓源性侧群细胞的体外增殖及其向肝样细胞分化的实验研究[D].遵义医学院,人体解剖与组织胚胎学,2014,硕士.
[38]韩春.M保险公司寿险业务操作风险管理研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[39]张凌飞.城市社区纠纷与多元化解[D].北方工业大学,法学理论,2013,硕士.
[40]任鹏宇.管道含气状态对水锤波速的影响研究[D].长安大学,市政工程,2013,硕士.
[41]吉文爱.中国特色社会主义的权力监督[D].中共中央党校,科学社会主义,2004,硕士.
[42]姚庆玲.中小企业信用担保机构全面风险管理研究[D].山东大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[43]张成平,张顶立,吴介普,骆建军.暗挖地铁车站下穿既有地铁隧道施工控制[J].中国铁道科学,2009,01:69-73.
[44]杨阳.基于AADL的车用嵌入式实时系统建模方法研究[D].湖南大学,计算机科学与技术,2012,硕士.
[45]张润连.乌海八中歌唱教学探究[D].内蒙古师范大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[46]吴泽豪.蝶阀系统温度场及其结构研究[D].武汉科技大学,机械设计及理论,2012,硕士.
[47]文宇.天津大学工程管理本科教育改革及其特色研究[D].天津大学,工程管理,2013,硕士.
[48]常丽君.科学家开发出石墨烯太赫兹设备样机[N].科技日报,2012-05-04002.
[49]于威.吉林省玉米作物保险风险区划研究[D].中国农业科学院,农村金融与保险（专业学位）,2012,硕士.
[50]王敏.艺术教学的教学艺术[D].湖南师范大学,音乐学,2004,硕士.