大鼠miR-185-3p调控的TrkB.FL信号通路抑制神经元痫样放电的研究

【摘要】研究目的：癫痫(Epilepsy)是一种常见的神经系统疾病,在研究癫痫发病机制的基础上,探索抑制癫痫发作的有效途径,具有重要的科学意义和临床应用价值。本论文在癫痫发生的TrkB(tropomyosin-relatedkinaseB)受体和TrkB信号通路角度,以大鼠海马神经元痫样放电模型(spontaneousrecurrentepileptiformdischarges,SREDs)为研究对象,通过大鼠miR-185-3p(miR-185*)激活全长型TrkB(TrkB.FL)信号通路,研究神经元电压门控性Ca2+通道(Voltage-gatedcalciumchannels,VGCCs)特性和痫样放电的抑制情况。探讨TrkB.FL信号通路激活后抑制癫痫发生的机制,为临床治疗癫痫提供创新的调控思路。研究方法：1.通过无镁液处理原代培养的大鼠海马神经元3h,构建神经元痫样放电模型。2.研究TrkB受体和TrkB信号通路在痫样放电模型中的变化机制。(1)通过实时荧光定量PCR和westernblotting检测全长型TrkB(TrkB.FL)和截短型TrkB(TrkB.T)受体在模型中的表达水平,并应用钙蛋白酶抑制剂和转录翻译抑制剂研究调控TrkB受体表达变化的机制。(2)使用BDNF处理模型,应用westernblotting检测磷酸化TrkB.FL受体蛋白的表达水平,研究模型中TrkB受体表达变化调控TrkB.FL信号通路活性的相关机制。3.研究miR-185*调控TrkB.FL信号通路活性后对痫样放电的影响。(1)利用包含miR-185*-pGLVHl/GFP表达载体的慢病毒转染模型,实时荧光定量PCR和westernblotting检测TrkB.T受体表达和TrkB.FL信号通路活性的改变。(2)全细胞膜片钳检测miR-185*转染模型中神经元VGCC电流和稳态激活与失活特性的变化。(3)全细胞膜片钳检测miR-185*转染模型中神经元放电的频率变化情况。4.应用翻译抑制剂孵育痫样放电模型,通过全细胞膜片钳检测神经元放电频率的变化,研究TrkB.FL信号通路活性改变后对痫样放电的影响。研究结果：1.大鼠海马神经元痫样放电模型的鉴定结果：与正常对照组神经元相比,模型组中神经元放电频率显著上升(P<0.001,n=9),inter-eventinterval累计分布曲线明显左移(P<0.001,n=9)。2.TrkB受体和TrkB信号通路在痫样放电模型中的变化结果：(1)在痫样放电模型中,TrkB.T受体较正常对照组表达增加(P<0.001,n=6),TrkB.FL受体表达降低(P<0.001,n=6)。与模型组相比,钙蛋白酶抑制剂孵育模型后,TrkB.FL受体表达上升(P<0.001,n=6)；转录或翻译抑制剂孵育模型后,TrkB.T受体表达均下降(P<0.001,n=6)。(2)与正常对照孵育BDNF组相比,BDNF处理痫样放电模型,或者BDNF处理模型再孵育钙蛋白酶抑制剂,以上两组磷酸化的TrkB.FL受体蛋白与总TrkB.FL受体蛋白的比值(pTrkB.FL/totalTrkB.FL)均降低(P<0.01,n=6),证明TrkB.FL信号通路活性被抑制。而BDNF处理痫样放电模型再孵育翻译抑制剂后,与BDNF处理模型组相比,pTrkB.FL/totalTrkB.FL比值升高(P<0.001,n=6),TrkB.FL信号通路被激活。3.利用miR-185*调控TrkB.FL信号通路活性后影响痫样放电的研究结果：(1)利用miR-185*转染痫样放电模型72h后,miR-185*在模型中持续大量的表达,并调控模型中TrkB.T受体表达减少(P<0.001,n=6)。miR-185*转染痫样放电模型后再经BDNF处理,与BDNF处理模型组相比,pTrkB.FL/totalTrkB.FL比值上升(P<0.001,n=4),TrkB.FL信号通路同样被激活。(2)痫样放电模型组中神经元VGCC电流和稳态激活与失活特性的相关参数与正常对照组比较后发现,VGCC最大电流密度升高(P<0.001,n=10-15)；激活曲线的V1/2和斜率因子k显著降低(P<0.001,n=7-10)。表示VGCC激活的阈电位减小,激活速度加快,通道相对容易被激活。模型组VGCC失活曲线的V1/2显著增加(P<0.001,n=7-9),而斜率因子k却显著降低(P<0.001,n=7-9)。表示VGCC失活的阈电位增加,失活速度变慢,通道相对更难失活。而miR-185*转染痫样放电模型后,VGCC特性的相关参数与未经转染的模型组相比,VGCC最大电流密度降低(P<0.001,n=10.15)；激活曲线的V1/2显著增加(P<0.01,n=7-10),斜率因子k也显著升高(P<0.001,n=7-10)。表示VGCC激活的阈电位升高,激活速度降低,通道相对难以激活。而VGCC失活曲线的V1/2变化虽然降低,但不显著(P>0.05,n=7-9),反而斜率因子k显著升高(P<0.05,n=7-9),表明VGCC失活速度加快,通道相对更容易失活。(3)miR-185*转染痫样放电模型后,与未经处理的模型相比,神经元放电频率显著降低(P<0.001,n=9),其inter-eventinterval累计分布曲线右移(P<0.001,n=9),结果显示转染模型神经元的痫样放电减弱。4.应用翻译抑制剂孵育痫样放电模型,TrkB.FL信号通路变化后对痫样放电的调节结果：与未经处理的模型相比,翻译抑制剂孵育模型后的神经元放电频率显著降低(P<0.001,n=9),inter-eventinterval累计分布曲线右移(P<0.001,n=9),神经元的痫样放电同样减弱。结论：1.大鼠海马神经元经无镁液处理3h后,成功构建痫样放电模型。2.痫样放电模型中,钙蛋白酶调控TrkB.FL受体表达减少,转录翻译过程参与TrkB.T受体表达的增加。TrkB.T受体的高表达抑制模型中TrkB.FL信号通路的激活。3.miR-185*激活TrkB.FL信号通路后,抑制痫样放电的产生。(1)miR-185*转染痫样放电模型,通过下调TrkB.T受体的表达,可以激活TrkB.FL信号通路。(2)激活的TrkB.FL信号通路抑制miR-185*转染模型神经元的VGCC电流和通道活性。(3)激活的TrkB.FL信号通路降低miR-185*转染模型神经元的放电频率。4.翻译抑制剂孵育痫样放电模型,激活的TrkB.FL信号通路同样降低了神经元的放电频率,最终抑制痫样放电。
【作者】谢伟；
【导师】田心；
【作者基本信息】天津医科大学，生物医学工程，2014，博士
【关键词】癫痫；痫样放电SREDs；TrkB.FL信号通路；miR-185~*；翻译抑制剂；TrkB.FL信号通路激活；抑制癫痫；

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