单纯性室间隔缺损的血浆差异蛋白质组学研究

【摘要】目的：一、本研究选择单纯性室间隔缺损(VentricularSeptalDefect,VSD)患儿作为研究对象,假设其血浆中某些蛋白质的表达受疾病影响而发生改变,以健康儿童为对照,通过蛋白质组学技术寻找并确定VSD患儿血浆中的特异性差异蛋白质。二、依据VSD的病理特点,分析和探讨差异蛋白质潜在的临床意义；希望找到VSD的特异性蛋白质作为筛查的生物标记物。三、探讨和总结蛋白质组学方法在先天性心脏病(CongenitalHeartDisease,CHD)中的研究方法和路线,为蛋白质组学技术今后在复杂CHD研究中的应用奠定基础。方法：一、选取55例连续的接受外科手术治疗的VSD患儿作为研究对象,同期健康儿童55例组成对照组。于术前晨起空腹抽静脉血2m1,置于EDTA抗凝采血管中,离心后收集血浆,于-80℃C超低温冰箱内储存。先由VSD组和对照组分别随机选取15例患儿血浆,充分混合后应用白蛋白/IgG去除试剂盒去除血浆中的高丰度蛋白,在进行样品血浆蛋白的稀释定量之后,将两组的血浆样本行双向电泳(2-DE),每组样本均重复进行2-DE3次,通过考马斯亮蓝凝胶染色和图像扫描选取差异蛋白质点。对差异蛋白质点进行基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)鉴定,得到蛋白质点的肽质量指纹图谱(PMF),然后利用GPS软件,在Swissprot蛋白数据库中搜索确定蛋白质种类。二、取另外40例VSD组和40例对照组患儿血浆,对鉴定出的差异蛋白质进行ELISA实验定量验证,以明确其表达变化与疾病是否存在显著关联。每个样本重复测量3次,计算其平均吸光值,根据标准曲线确定样品浓度,实验组和对照组之间的浓度差异应用非配对t检验进行统计,P<0.05则认为差异显著。结果：一、2-DE的结果经GS-800图像采集和PD-Quest软件分析,在VSD组中分别检测到蛋白点325个,320个和317个,匹配率97.25%；在对照组中分别检测到蛋白点318个,313个和316个,匹配率98.11%。筛选确定差异蛋白位点4个,其中3个表达下调,1个表达上调。经MALDI-TOF质谱鉴定,表达下调的蛋白质为血清淀粉样蛋白P(SAP)、触珠蛋白(Hp)、纤维胶凝蛋白-3(Ficolin-3),表达上调蛋白质为α-1-酸性糖蛋白(α1-AGP)。二、40例样本的VSD组ELISA实验测定血浆SAP浓度为3.818±0.2294ng/ml,Hp浓度为0.3965±0.04186mg/ml,Ficolin-3浓度为5.548±0.343ug/ml,α1-AGP浓度为3.086±0.1294mg/ml;40例健康儿童对照组血浆SAP浓度为6.270±0.7723ng/ml,Hp浓度为0.5994±0.07097mg/ml,Ficolin-3浓度为10.576±1.576ug/ml,α,-AGP浓度为2.302±0.1071mg/ml。与对照组相比,VSD组患儿血浆中SAP呈显著低表达(P=0.0029),Hp呈显著低表达(P=0.016),Ficolin-3呈显著低表达(P=0.003),α1-AGP呈显著高表达(P<0.0001),以上差异均具有统计学意义,并与2-DE测定出的结果相符。结论：本研究通过蛋白质组技术,在VSD患儿与健康人群之间发现了4种血浆差异蛋白质；并经更大样本的ELISA实验证实。其中SAP表达下调提示VSD患儿的免疫应答与炎症反应发生了变化。Hp表达下调则与VSD患儿对呼吸道感染的抵抗力下降和容易并发肺动脉高压有关。Ficolin-3的下调可能与VSD患儿易患呼吸道感染有关,而且提示VSD患者可能存在FCN3基因缺陷。而表达上调的α1-AGP可能与VSD患儿的相对应激状态有关,其有可能作为评判VSD患儿应激强度和选择手术时机的生物标记物。差异蛋白质的发现对于深入了解VSD的病理特点具有实际意义,而且为进一步的机制研究和生物标记物研究指明了方向。本研究也显示出蛋白质组学技术在CHD研究中的价值,为今后在复杂CHD研究中的应用奠定了基础。
【作者】王凯；
【导师】李彤；
【作者基本信息】天津医科大学，外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】蛋白质组学；先天性心脏病；室间隔缺损；差异蛋白质双向电泳；质谱技术；ELISA；

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