Wnt10a/Wnt10b及其Wnt/β-catenin通路在子宫内膜癌中的作用研究

【摘要】第一部分Wnt10aa和Wnt10b在子宫内膜癌中的表达和临床意义目的：通过检测Wnt10a及Wnt10b在不同状态子宫内膜组织中表达,分析其与子宫内膜癌(EC)患者临床病理特征及预后的关系,探讨Wnt10a及Wnt10b在EC发生发展中的作用,判断EC的生物学行为。为EC病因学研究及预后判断提供科学依据。方法：本研究选取2001年1月至2010年12月在天津医科大学总医院妇产科住院的新发EC标本102例。其中包括95例雌激素依赖型(Ⅰ型)子宫内膜癌(其中12例子宫内膜癌伴鳞状分化)与7例非雌激素依赖型(Ⅱ型)EC(2例浆乳癌,4例粘液腺癌,1例透明细胞癌)。对照组：单纯性增生子宫内膜(SHE)18例,复杂性增生子宫内膜(CHE)6例,非典型增生子宫内膜(AHE)30例,正常子宫内膜(NE)84例(其中增生期48例、分泌期36例),所有标本均经病理学证实,其中子宫内膜癌标本均为原发病例且术前未接受过其他方法治疗。收集以上标本制作组织芯片,应用免疫组化SP法检测Wnt10a和Wnt10b在不同子宫内膜组织中的表达情况。采用SPSS14.0软件包进行数据分析,采用卡方(Χ2)检验和Spearman等级相关分析,应用Kaplan-Mei法进行单因素生存曲线分析。P<0.05视为差异具有显著性。结果：1.Wnt10a在EC组阳性表达率高于AHE、CHE、SHE及NE组,但差异无统计学意义,P>0.05(Χ2=2.81,P=0.25)；Wnt10b在EC、AHE、CHE、SHE及NE组的阳性表达率逐渐下降,差异有统计学意义,P<0.05(Χ2=8.12,P=0.02)。2.Wnt10a在子宫内膜样腺癌中的阳性表达率高于非子宫内膜样腺癌,差异有统计学意义,P<0.05(Χ2=4.75,P=0.03)；然而,Wnt10a在EC组织学分级、子宫肌层浸润、淋巴结转移以及手术病理分期(FIGO分期)各亚组中的阳性表达率无统计学差异,P>0.05(P=0.36,P=0.75,P=0.37,P=0.54)。Wnt10b在子宫内膜样腺癌中的阳性表达率高于非子宫内膜样癌,差异有统计学意义,P<0.05(Χ2=2.81,P=0.04)。Wnt10b在高分化(G1)、中分化(G2)和低分化(G3)组EC中阳性表达率逐渐降低,差异有统计学意义,P<0.05(Χ2=6.87,P=0.03)；Wnt10b在淋巴结转移阴性组阳性表达率高于淋巴结转移阳性组P<0.05(P=0.02)；Wnt10b在FIGO分期各亚组中阳性表达率有统计学差异,P<0.05(P=0.04)；Wnt10b在EC肌层浸润各亚组中的阳性表达率无统计学差异,P>0.05(Χ2=2.27,P=0.13)。3.Wnt10a和Wnt10b在EC组织中的表达无明显相关性,P>0.05(rs=0.08,P=0.43)。4.预后分析：对102例EC患者进行随访。Wnt10a阳性表达与阴性表达患者的预后没有明显差别,P>0.05(Χ2=0.027,P=0.868)。然而,Wnt10b高表达组EC患者的预后好于低表达组,差异有统计学意义,P<0.05(Χ2=3.952,P=0.047)。结论：Wnt10b在EC发生发展中很可能起到重要作用。Wnt10b表达阳性组的患者预后好于阴性组患者。然而,Wnt10a在EC中的作用仍需要进一步研究。第二部分子宫内膜癌与经典Wnt信号通路相关性的研究目的：观察Wnt10b基因通过经典Wnt/β-catenin信号通路对子宫内膜癌细胞增殖与凋亡的作用机理,进一步证实经典Wnt信号通路在EC发生发展中的作用,为EC发病机理提供理论依据。方法：Wnt10b在AN3CA细胞系中呈低表达状态,而在Ishikawa3-H.12细胞系中呈高表达状态。因此,本研究采用上述两种EC细胞系作为体外细胞模型,观察了Wnt10b对Wnt/β-catenin信号传导通路关键因子β-catenin、APC、c-myc的变化影响。细胞的复苏、培养、传代、冻存,均严格按照无菌操作要求进行。MTT法检测细胞增殖状态。流式细胞仪检测细胞凋亡。质粒转染及siRNA干扰后检测WWnt10b在mRNA水平上对Wnt/β-catenin信号传导通路关键因子β-catenin、APC、c-myc的影响。Western-blot法检测Wnt/β-cateninn信号通路关键蛋白β-catenin、APC、c-myc的表达含量。数据用SPSS14.0统计软件进行方差分析、Fisher精确检验和t检验,P<0.05视为差异具有显著性。结果：1.Wnt10b对EC细胞增殖的影响：在AN3CA细胞系过表达Wntl0b后,其细胞增殖水平明显高于阴性对照组和空白对照组；在Ishikawa3-H-12细胞系敲降Wnt10b,结果显示,Wnt10b敲掉组的细胞增殖水平明显低于阴性对照组和空白对照组。说明Wnt10b具有促进EC细胞增殖的作用。2.Wnt10b对EC细胞凋亡的影响：在本研究中同样采用AN3CA和Ishikawa3-H-12细胞系观察Wnt10b对EC细胞凋亡的影响。流式细胞仪检测各组细胞的凋亡水平。在AN3CA细胞中过表达Wnt10b后,其细胞凋亡率明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。与此相对应,在Ishikawa3-H-12细胞中敲降Wnt10b后,其细胞凋亡率明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。说明Wnt10b具有明显抑制EC细胞凋亡的作用。3.Wnt10b对Wnt/B-catenin信号通路关键因子在转录水平的影响：(1)在ECAN3CA细胞系中转染Wnt10b过表达质粒,RT-PCR方法观察转染效率,Wnt10b表达明显增加,说明转染成功。我们发现B-catenin和c-myc表达明显增加,而APC表达下降。(2)在Ishikawa3-H-12细胞系中敲降Wnt10b,RT-PCR验证敲降效率比较明显,β-catenin和c-myc表达下降,而APC表达上升。说明Wnt10b在转录水平上通过活化经典Wnt/β-catenin信号通路中的关键因子,诱导靶基因表达,从而促进EC细胞增殖和抑制其凋亡。4.Wnt10b对Wnt/β-catenin信号通路关键因子在翻译水平的影响：(1)在AN3CA细胞系中转染Wnt10b过表达质粒,WesternBlot方法观察转染效率比较明显,Wnt10b蛋白表达明显增加,同时,β-catenin和c-myc表达也明显增加,而APC表达明显下降。(2)在Ishikawa3-H-12细胞系中敲降Wnt10b,WesternBlot方法验证敲降效率比较明显。Wnt10b蛋白表达明显下降,同时,β-catenin和c-myc表达也明显下降,而APC表达明显上升。说明Wnt10b蛋白通过活化经典Wnt/β-catenin信号通路中的关键蛋白,诱导靶基因表达,从而促进EC细胞增殖和抑制其凋亡。结论：Wnt10b在EC的发生发展中可能起到了重要作用,其机理涉及经典Wnt/β-catenin信号传导通路的激活及其对下游基因的调控。结合本研究结果进行分析,Wnt10b在EC细胞中的过表达可激活经典Wnt/β-catenin信号传导通路,降低其负调控因子APC的表达,促进β-catenin的表达,进而激活c-myc基因的转录和翻译,促进EC的发生发展。
【作者】陈红漫；
【导师】薛凤霞；
【作者基本信息】天津医科大学，妇产科学（专业学位），2014，博士
【关键词】子宫内膜癌；Wnt10a；Wnt10b；Wnt/β-catenin；信号传导通路；β-catenin；APC；c-myc；

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