免疫相关性全血细胞减少症患者遗传易感性的初步研究

【摘要】目的：1.研究免疫相关性全血细胞减少症(immuno-relatedpancytopenia,IRP)患者CD4+T细胞DNA总体甲基化状态以及甲基化相关调控基因的表达,从而探讨IRP的表观遗传学改变。2.研究IRP患者外周血CD4+T细胞CD70的表达及其启动子甲基化状态,与临床指标进行相关性分析,以明确其在IRP发生发展过程中的作用。3.检测IRP患者4种免疫相关基因的单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)的变化,探索已知免疫相关易感基因的SNP与中国汉族人群IRP易感性的关系。方法：第一部分：密度梯度离心分离30例IRP患者和15名正常对照的外周血单个核细胞,使用磁珠分选CD4+T淋巴细胞,分别应用DNAout试剂盒和TRIZol提取病例组和对照组CD4+T细胞的DNA和RNA,应用总体甲基化定量试剂盒检测IRP患者和正常对照的DNA总体甲基化水平,采用实时定量聚合链式反应(real-timepolymerasechainreaction,RT-PCR)检测多种DNA甲基转移酶(DNMT)和甲基结合蛋白(MBD)的mRNA表达,并进行统计学分析。第二部分：密度梯度离心分离35例IRP患者和15名正常对照的外周血单个核细胞,使用磁珠分选CD4+T淋巴细胞,使用FCM检测外周血CD4+T淋巴细胞上CD70+细胞的表达；应用RT-PCR的方法检测外周血CD4+T淋巴细胞中CD70的mRNA的表达水平；应用甲基化试剂盒处理外周血CD4+T淋巴细胞,应用MSP法检测CD70细胞启动子甲基化水平,对上述实验结果及临床指标进行统计学分析。第三部分：密度梯度法离心分离213例IRP患者及112名正常对照的外周血单个核细胞,应用DNAout试剂盒提取的单个核细胞基因组DNA,根据GenBank数据库设计引物扩增待测目的位点附近DNA序列,送金唯智生物科技有限公司检测目的位点(rs1800871、rs2476601、rs9463772、rsl3277113)的SNP变化,并进行统计学分析。结果：第一部分：与正常对照组比较,IRP患者外周血CD4+T淋巴细胞DNA总体甲基化水平明显降低(p<0.05)；初治组和恢复组IRP患者CD4+T细胞DNA总体甲基化水平分别为(3.525±2.046)%和(4.790±1.471)%,均明显低于正常对照组(10.101±3.449)%,有统计学意义(均P<0.05)；初治组和恢复组间无统计学差异(p=0.062)。IRP患者CD4+T淋巴细胞中DNMT3b在初治组的相对表达量显著低于对照组(1.332±0.785vs2.077±1.059,p<0.05),上述两组与恢复组间差异均无统计学意义。MBD2的相对表达量在初治组和恢复组均显著高于对照组(2.999±1.601和2.055±1.576vs0.581±0.247,p<0.05),初治组与恢复组间差异无统计学意义(p>0.05)。MBD4在初治组中mRNA表达水平显著高于正常对照组(2.736±2.719vs1.167±1.006,p<0.05),初治组与恢复组和恢复组与对照组组间比较均无统计学意义(p>0.05)。DNMT1、MBD1和MBD3的mRNA的表达差异在初治组、恢复组及正常对照组间两两比较均无统计学意义(均p>0.05)。外周血CD4+T细胞DNMT3bmRNA表达水平与CD4+T细胞基因组DNA总体甲基化水平呈正相关(r=0.569,P<0.05)。MBD2mRNA表达水平分别与CD4+T细胞基因组DNA总体甲基化水平和Thl/Th2比值呈负相关(r值分别为-0.763和-0.652,p均<0.05)。第二部分：流式细胞术检测IRP患者外周血CD4+T淋巴细胞表面CD70的表达水平初治组、恢复组、正常对照组三组CD70mRNA的表达水平分别为2.314(0.200～6.084)、1.021(0.135～3.434)、0.353(0.008～2.258),两两比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)。CD4+T淋巴细胞表面CD70表达水平比较：初治组、恢复组、正常对照组三组CD4+CD70+/CD4+的细胞比例分别为7.46±1.51%、5.95±1.34%、1.83±0.6%,两两比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)。CD4+T淋巴细胞中CD70启动子甲基化状态的比较：初治组、恢复组及正常对照组间两两比较CD70启动子甲基化状态均无显著差异(p>0.05)。与所有IRP患者比较,正常对照组CD70启动子甲基化水平明显升高(p<0.05)。IRP患者外周血CD4+T淋巴细胞上CD70的表达率与骨髓CD5+CD19+/CD19+的细胞比例呈正相关(r=0.533,p<0.001)。第三部分：所有标本中PTPN22rs2476601基因位点测得的结果均为G,未发现PTPN22rs2476601存在基因多态性。与正常对照组比较IRP患者IL-10rs1800871基因型及等位基因频率分布差异均无统计学意义(p>0.05)。等位基因A为BLKrs13277113的风险等位基因(OR=1.616,95%CI=1.113-2.347,p=0.015),携带该突变基因的患者患IRP的发病率是正常患者的1.616倍,IRP病例组AA基因型与正常对照组比较,OR=5.263,p=0.009,提示AA基因型与IRP发病显著相关,携带该基因型人群的患病率是正常人群的5.263倍。IRP患者中携带风险等位基因A的基因型AA+GA的频数显著高于正常对照(OR=4.566,95%CI=1.373-15.176,P=0.017)。IRP患者和正常对照比较,IRP患者携带IL-17Frs9463772T等位基因突变的频数是(14.6%vs.8.9%,OR=1.737,95%CI=1.020～2.959,p=0.04)明显高于正常对照,提示等位基因T的该位点的风险等位基因,携带该突变基因的人群患IRP的发病率是正常患者的1.737倍。IRP患者中携带该风险等位基因的基因型TT+TC的频数显著高于正常对照(OR=2.14,95%CI=1.162～3.942,p=0.019)。结论：1.IRP患者CD4+T淋巴细胞基因组DNA总体甲基化水平降低,且甲基化相关调控基因表达异常。CD4+T细胞基因组DNA总体甲基化水平与DNMT3bmRNA表达水平呈正相关,与MBD2mRNA表达水平呈负相关。MBD2mRNA表达水平与Th1/Th2水平呈负相关,提示低甲基化状态及甲基化相关调控基因的异常参与自身抗体的产生,与IRP的免疫状态相关。2.IRP患者CD4+T淋巴细胞中CD70过度表达与其基因启动子调控序列低甲基化相关,与产生自身抗体的CD5+B淋巴细胞的数量正相关,说明CD70的过表达在IRP的发病机制中发挥作用。3.中国汉族人群中BLKrs13277113和IL-17Frs9463772的SNP与IRP的易感性存在相关性；而PTPN22rs2476601和IL-10rs1800871的SNP突变均与IRP的发病无关。
【作者】任悦；
【导师】邵宗鸿；
【作者基本信息】天津医科大学，内科学（专业学位），2014，博士
【关键词】免疫相关性血细胞减少症；单核苷酸多态性；CD70；DNA甲基化甲基结合蛋白；DNA甲基转移酶；CD4~+T细胞；自身抗体；

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