Wnt5a信号通路在结肠癌血管生成拟态及EMT中的作用

【摘要】研究背景和目的：结肠癌是世界范围内发病较为广泛的恶性肿瘤之一,肿瘤的转移和复发严重威胁结肠癌病人的生命。肿瘤的生长以及转移需依赖肿瘤组织中的血管生成。血管生成拟态(vasculogenicmimicry,VM)是一种不依赖内皮细胞的全新肿瘤微循环模式,已有研究报道发现多种恶性肿瘤中存在VM,如肝癌、前列腺癌、卵巢癌等。前期研究结论证实结肠癌中存在VM,且VM与肿瘤的恶性度相关,与临床不良预后有关。结肠癌中VM的详细形成机制至今不明,已有研究结果证实上皮间充质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)以及经典Wnt/β-catenin信号通路的过度活化在结肠癌VM形成中起重要作用。本课题组前期研究己发现在结肠癌组织中存在Wnt/β-catenin信号通路的过度活化并且参与启动EMT。已有研究报道称非经典Wnt信号通路可促进肿瘤细胞迁移,通过激活转录因子启动EMT。非经典Wnt信号通路中最重要的Wnt分泌蛋白Wnt5a在胃癌、乳腺癌、前列腺癌等中存在促进肿瘤的侵袭和转移的作用,Wnt5a可促进多种肿瘤细胞发生EMT。而非经典Wnt信号通路在结肠癌中的作用研究却相对甚少且不一致,因此我们遴选非经典Wnt信号通路中Wnt5a作为研究对象,探讨Wnt5a信号通路在结肠癌VM形成机制中可能存在的作用。本研究利用免疫组化技术初步分析了217例结肠癌病例组织中Wnt5a的表达情况,并结合前期实验结果进一步探讨Wnt5a与EMT相关蛋白以及VM形成的关系,并利用细胞转染技术、分子生物学技术及免疫缺陷小鼠肿瘤细胞移植瘤模型进一步探究Wnt5a对结肠癌细胞EMT及VM形成的影响,以期阐明非经典Wnt信号通路在结肠癌中的作用。研究方法：1)免疫组织化学染色方法检测217例结肠癌组织标本中Wnt5a的表达,并结合临床病理资料以及生存情况随访记录结果,分析Wnt5a的表达与临床病理特征的关系以及Wnt5a的表达与患者生存预后的关系。结合前期试验结果,分析Wnt5a的表达与结肠癌中EMT相关蛋白E-cadherin以及Vimentin的关系,以及与结肠癌中经典Wnt/β-catenin信号通路关键调控蛋白β-catenin的关系。2)建立异常Wnt5a基因表达的结肠癌细胞系,验证Wnt5a基因过表达以及降表达效果,筛选稳定过或者降表达Wnt5a的结肠癌HCT116细胞。3)WesternBlot以及免疫荧光检测Wnt5a对结肠癌EMT以及经典Wnt/β-catenin信号通路的影响。4)MTT实验以及软琼脂克隆形成实验验证Wnt5a对HCT116细胞增殖能力的影响作用；划痕实验以及侵袭实验检测Wnt5a对HCT116细胞运动迁移以及侵袭能力的影响；细胞粘附实验检测Wnt5a对细胞粘附的作用。5)动物实验体内检测Wnt5a对结肠癌细胞体内成瘤能力的影响,并以免疫组化染色方法检测移植瘤中EMT相关蛋白的表达。6)细胞流式术检测Wnt5a对结肠癌细胞内钙离子浓度的影响作用。7)通过细胞三维培养技术检测Wnt5a对结肠癌细胞成管能力的影响,并通过Real-timePCR以及WesternBlot检测Wnt5a对血管生成相关蛋白的作用。结果：1.Wnt5a在结肠癌中表达下降,Wnt5a阳性表达与患者的良好临床预后有关。Wnt5a的表达与结肠癌EMT相关蛋白呈负性相关关系。Wnt5a可能通过抑制经典Wnt/β-catenin言号通路活化来抑制EMT。Wnt5a在VM阴性患者的表达比率较高,提示Wnt5a可能抑制结肠癌中VM的形成。2)Wnt5a在结肠癌细胞系中普遍呈低表达状态,成功构建基因调控Wnt5a表达的结肠癌HCT116细胞。3)Wnt5a可通过下调EMT相关的转录因子抑制结肠癌细胞EMT过程,结肠癌细胞系HCT116中过表达Wnt5a后可拮抗经典Wnt/β-catenin信号通路。4)Wnt5a过表达可明显抑制HCT116细胞的增殖；Wnt5a可抑制结肠癌细胞的侵袭和迁移能力；Wnt5a可增强细胞粘附能力。5)Wnt5a抑制体内小鼠体内移植瘤的生长,且抑制瘤体组织中EMT相关蛋白的表达。6)Wnt5a可促进细胞内钙离子浓度升高,从而激活Wnt/Ca2+信号途径。7)Wnt5a抑制HCT116细胞管道样结构的形成能力,并抑制促血管生成因子蛋白水平的表达。结论：Wnt5a作为抑癌基因在结肠癌中呈普遍性低表达或者失表达,Wnt5a的阳性表达与结肠癌良好的临床预后相关。Wnt5a可拮抗经典Wnt/β-catenin信号通路及与之有关的EMT过程。Wnt5a可通过激活Wnt/Ca2+信号途径操控促进凋亡蛋白Bax的表达,抑制细胞生长。Wnt5a抑制细胞的侵袭迁移能力并抑制VM形成。
【作者】程润芬；
【导师】孙保存；
【作者基本信息】天津医科大学，肿瘤学，2014，博士
【关键词】结肠癌；血管生成拟态；Wnt5a；上皮间充质转化；Wnt/Ca2+信号通路；

【参考文献】
[1]毕建欣,张岐山.关联规则挖掘算法综述[J].中国工程科学,2005,04:88-94.
[2]万春喜.雷公藤有效部位纳米结构脂质载体的制备及其对IgA肾病小鼠的药效研究[D].华中科技大学,生物制药工程,2013,硕士.
[3]陈东华,吴睿,谢少军,周波.基于FPGA的三相四线有源滤波器的电流控制方案[J].电力系统自动化,2006,03:56-60.
[4]马惠珍.客车企业B2C型电子商务网站的研究与开发实践[D].长安大学,2004.
[5]陈瑜,倪健.利用孢粉记录定量重建大尺度古植被格局[J].植物生态学报,2008,05:1201-1212.
[6]苗成龙.肝细胞肝癌组织中Wnt5a、β-catenin、GPC-3的表达及意义[D].苏州大学,普通外科学,2014,硕士.
[7]兰馨辉.林丹在水环境多固相共存体系中的吸附特征[D].吉林大学,环境科学,2013,硕士.
[8]刘乐浩,李铁虎,赵廷凯,王大为.石墨烯的研究进展[J].材料导报,2012,09:37-41+51.
[9]张雪彪.船体曲面钢板完全线加热成形研究[D].大连理工大学,2006.
[10]徐晓波.鱼眼摄像机标定及图像特征点匹配方法研究[D].北京化工大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[11]那娜.农业产业化经营组织的发展研究[D].哈尔滨理工大学,技术经济及管理,2012,硕士.
[12]王华宜.基于Android平台的视频监控[D].华南理工大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[13]李宏.老年性白内障手术术前视力调查[D].大连医科大学,眼科学,2012,硕士.
[14]潘杰.茶树抗性相关蛋白（Cs-cystatin,Cs-Rip）对假眼小绿叶蝉消化道组织的影响[D].厦门大学,动物学,2014,硕士.
[15]朱海燕.巢湖流域葡萄园土壤养分变化及氮磷流失特征研究[D].安徽农业大学,农业资源利用,2011,硕士.
[16]王文超.高标准基本农田规划研究[D].浙江大学,2013.
[17]孙立成.船舶避碰决策数学模型的研究[D].大连海事大学,2000.
[18]杨小浩.基于文件流处理的变声器的设计和实现[D].大连理工大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[19]董浩.生菜离体再生体系的建立及其rbcS基因启动子的获得[D].西北大学,细胞生物学,2013,硕士.
[20]孟瑞.矮负面身体自我大学生的认知偏向研究[D].西南大学,基础心理学,2013,硕士.
[21]袁珍.金字塔铭文中的奥西里斯神话[D].复旦大学,世界史,2012,硕士.
[22]陈波.ABC水泥股份有限公司ERP实施规划[D].西南财经大学,工商管理,2003,硕士.
[23]崔文元.星系中子辐照量分布函数[D].河北师范大学,理论物理,2004,硕士.
[24]刘楠楠.羊peroxiredoxin 6全长cDNA克隆、表达及ELISA检测方法的建立[D].吉林大学,兽医,2013,硕士.
[25]吉锡媛.不平等权势关系下缓和人际冲突的策略的语用研究[D].广东外语外贸大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[26]马燕峰,刘伟东,赵书强.基于包络线拟合的低频振荡性质在线判别[J].电力系统自动化,2014,23:46-53+95.
[27]张晓航.数据分析在WAP交叉销售中的应用[J].通信企业管理,2005,09:74-76.
[28]邵艳春.二语阅读中阅读目的对伴随性词汇习得的影响研究[D].浙江师范大学,外国语言学及应用语言学,2004,硕士.
[29]邱忠献.论代位权的行使[D].湘潭大学,法律,2003,硕士.
[30]宋茹.基于复杂场景的人脸检测与人脸跟踪的研究与实现[D].安徽大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[31]高倩.拉卜楞寺的调查与研究[D].兰州大学,考古学及博物馆学,2013,硕士.
[32]陈亮.高速公路隧道SMA路面明色铺装技术研究[D].重庆交通大学,道路与铁道工程,2011,硕士.
[33]王邦军.中国软件企业管理创新研究[D].武汉理工大学,管理科学与工程,2004,硕士.
[34]赖安婷.群体情绪传播途径及其影响因素[D].首都师范大学,发展与教育心理学,2013,硕士.
[35]贺斌.高中性教育存在的主要问题与管理对策研究[D].华东师范大学,教育,2003,硕士.
[36]李芬英.中国区域信息化评价指标体系研究[D].浙江大学,2007.
[37]申晋波.低功率激光对一次性离心力竭运动大鼠跟腱微损伤的修复作用[D].苏州大学,运动人体科学,2012,硕士.
[38]卜婷婷.基于非市场价值的农地非农化配置与调控机制研究[D].南京农业大学,土地资源管理,2012,硕士.
[39]王世亮,何志侠,陈殿良,储成顶,叶红杨,江玲.生物样品中游离铂与总铂浓度的石墨炉AAS测定[J].中国新药杂志,2014,22:2681-2686.
[40]丁毅.马钢原料厂计算机控制系统[J].冶金自动化,1994,02:51-52.
[41]汪洋.天然药物刺五加提取物缓释微球的研制[D].兰州大学,药剂学,2012,硕士.
[42]王海强,黄海.扩张状态观测器的性能与应用[J].控制与决策,2013,07:1078-1082.
[43]李彦鹏,马在田.快慢波分离及其在裂隙检测中的应用[J].石油地球物理勘探,2000,04:428-432+544.
[44]吕岩,王志永,张浩,房进,曹高萍,施祖进,王碧燕.电弧法制备石墨烯的孔结构和电化学性能研究[J].无机材料学报,2010,07:725-728.
[45]曹金儒.武术服装的发展研究[D].华中师范大学,体育教学,2013,硕士.
[46]王彬.基于无线虚拟社区的精确广告模式研究[D].大连大学,管理科学与工程,2012,硕士.
[47]赵玉林,宋伟.配电变压器无触点有载调压中反并联晶闸管光纤触发方案[J].电力系统自动化,2013,20:97-101.
[48]陈文涛.烟草异物在线高速模式识别与剔除技术研究[D].重庆大学,2003.
[49]许晓伟.城市轨道交通列车运营仿真系统研究[D].上海工程技术大学,车辆工程,2013,硕士.
[50]张桂萍,韩淑芹,褚美玲.中国学生课堂环境下主动词汇与被动词汇的发展——一项英语专业与非英语专业大学生的对比研究[J].现代外语,2005,04:48-56+111-112.