IL-35基因修饰间充质干细胞治疗小鼠溃疡性结肠炎的实验研究

【摘要】本课题研究白介素35(interleukin35,IL-35)基因修饰间充质干细胞对小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用,并探讨其作用机制。通过建立稳定的小鼠溃疡性结肠炎模型,经尾静脉注射IL-35基因修饰的间充质干细胞,观察其对小鼠急性溃疡性结肠炎的治疗效果,探索出治疗溃疡性结肠炎新途径。一、IL-35基因修饰C57BL/6小鼠间充质干细胞制备目的：构建IL-35过表达慢病毒载体,以其感染小鼠间充质干细胞,从而获得IL-35基因修饰的间充质干细胞。方法：采用I型胶原酶消化法获得小鼠脂肪来源间充质干细胞,并以流式细胞术(FCM)和定向诱导分化实验加以鉴定；应用DNA聚合酶将IL-35基因连接入慢病毒工作质粒,测序鉴定无误后与包装质粒共转染包装细胞获得过表达IL-35慢病毒颗粒；以过表达IL-35慢病毒颗粒感染小鼠间充质干细胞,采用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测不同感染条件下细胞上清中IL-35的表达情况,从而获得IL-35基因修饰的间充质干细胞。结果：脂肪来源间充质干细胞获取成功；过表达IL-35慢病毒载体可以成功感染间充质干细胞,感染后细胞上清中IL-35蛋白浓度可达329.5±16.5pg/ml.二、C57BL/6小鼠急性溃疡性结肠炎模型构建目的：建立C57BL/6小鼠急性溃疡性模型。方法：应用不同浓度葡聚糖硫酸钠(DSS)喂养小鼠7日,每日记录体重变化及一般情况改变,第8日处死小鼠,观察结肠大体标本；将结肠标本石蜡包埋后切片检查,HE染色评估病理改变。结果：2%DSS可成功、稳定诱导小鼠急性溃疡性结肠炎,模型组小鼠结肠长度为4.10±0.03cm,较对照组6.17±0.10cm明显缩短(P<0.001),第4日后,模型组较对照组体重明显减轻(P<0.05)。三、IL-35基因修饰间充质干细胞对小鼠急性溃疡性结肠炎保护作用的研究目的：观察IL-35基因修饰间充质干细胞(IL-35-MSCs)对小鼠急性溃疡性结肠炎的保护作用,并探讨其机制。方法：在DSS喂养第2、4、6天尾静脉注射IL-35基因修饰间充质干细胞,并与注射间充质干细胞(MSCs)和生理盐水(对照)的小鼠进行对比；观察不同组间小鼠一般情况及病理改变；采用实时定量聚合酶链式反应(RealTimePCR)及流式细胞术(FCM)对不同组小鼠结肠标本进行分析,测定结肠标本中IL-17、TNF-а、IFNγ的表达情况和结肠固有层淋巴细胞(LPL)中CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞(Treg)分布情况。结果：①IL-35-MSCs注射组小鼠体重下降趋势较对照组变缓,但与MSCs注射组无明显差异。②IL-35-MSCs注射组小鼠结肠标本长度(4.75±0.05cm)较MSCs注射组(4.06±0.04cm)及对照组(4.03±0.07cm)显著变长(P<0.001),病理评分显著降低(P<0.001)。③IL-35-MSCs注射组LPL中Treg分布(7.3±0.2%)较另外两组显著升高(P<0.001)。IL-35-MSCs注射组小鼠结肠mRNA水平IL-17表达量较另外两组升高(P<0.001),而TNF-α和IFN-γ表达降低(P<0.001)。结论：IL-35基因修饰的间充质干细胞对DSS诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎有保护作用。其机制可能是通过刺激CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞的生成、上调结肠中IL-17的表达、下调TNF-α和IFN-γ表达,从而抑制局部免疫反应实现的。IL-35基因修饰的间充质干细胞可能成为治疗溃疡性结肠炎的新途径。
【作者】闫永嘉；
【导师】刘彤；
【作者基本信息】天津医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】白介素-35；间充质干细胞；CD4~+CD25~+FoxP3~+调节性T细胞；白介素-17；TNF-α；IFN-γ；

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