上转换纳米颗粒介导的光动力疗法修复脊髓损伤的实验研究

【摘要】[目的]观察在体外共培养并且接受980nm近红外线照射后,上转换纳米颗粒(UCNPs-PEG-M540)对幼年SpragueDawley(SD)大鼠脊髓星形胶质细胞的杀伤作用。探讨UCNPs介导的光动力疗法在促进大鼠脊髓损伤后减少损伤区胶质瘢痕的形成和行为功能恢复方面所起的作用。[方法]采用溶剂热法合成具有核壳结构的上转换纳米颗粒(NaYF4:Yb3+,Er3+/NaYF4,UCNPs),并用键联的方法在颗粒表面包裹聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)和部花青M540(Merocyanine540)。颗粒(NaYF4:Yb3+,Er3+/NaYF4-PEG-M540,UCNPs-PEG-M540)在体外被波长980nm的近红外线激光照射后,用二苯基异苯并呋喃(Diphenylisobenzofuran,DPBF)检测是否有单线态氧(singletoxygen,1O2)的产生。取实验用幼年SD鼠2只,麻醉后取出脊髓组织并剪碎,置入装有细胞培养液的培养瓶中培养,采用差速黏附和恒温摇床震摇法对细胞进行纯化。细胞在体外增殖,传代后,对其用GFAP免疫组化染色进行鉴定,并观察生长状况。传至第2代后,将星形胶质细胞收集并与颗粒共培养24小时,用波长980nm的近红外线激光照射后,MTT观察细胞存活情况。并用电镜观察细胞器结构的变化。与此同时,用NYUImpactor-II打击器制作SpragueDawley大鼠胸10脊髓损伤模型(打击重量和高度为：10g×50mm)。将80只脊髓损伤大鼠随机分成4组：DMEM移植组；M540移植组：UCNPs-PEG移植组；UCNPs-PEG-M540移植组。大鼠脊髓损伤1周后,将上述4种移植物分别移植到4组大鼠脊髓损伤区周围。术后采用BBB评分对大鼠的行为功能恢复情况进行评价。12周后,从每组随机选取8只大鼠进行10%BDA顺行示踪标记。标记两周后处死动物,将损伤段脊髓取出作5μm快速冰冻切片后,进行BDA显影,GFAP和NF200免疫组化染色。BWesternblot定量分析GFAP在脊髓损伤区的表达。图片用imageproplus5.0和ImageJ软件处理,根据阳性反应的积分光密度值(IOD)进行组间比较。[结果]透射电子显微镜(TEM)显示制备出的颗粒裸核NaYF4:Yb3+,Er3+基本呈六角状,且粒径比较均匀,通过粒度分析仪检测,结果显示颗粒直径在28nm左右。包壳后纳米颗粒的形状仍为六角状,纳米晶的平均尺寸为43nm。X-射线衍射(XRD)分析显示,包壳后纳米颗粒的衍射图谱与包壳前几乎一致。裸核及核壳结构纳米颗粒XRD图均与标准的六角相纳米颗粒NaYF4的衍射谱衍射峰的峰位吻合的很好,这说明本实验所制备出来的裸核颗粒及核壳结构纳米颗粒均是纯的六角相的纳米颗粒。傅立叶红外光谱证明在颗粒NaYF4:Yb3+,Er3+/NaYF4的表面成功的包覆上了PEG。能量色散X射线光谱分析(EnergyDispersiveX-Rayspectrometry,EDX)证明M540被成功的连接到颗粒表面。DPBF在410nm处的吸光度明显减低,说明经近红外线激发后,UCNPs-PEG-M540使周围的溶液中产生了单态氧。从幼鼠脊髓分离的星形胶质细胞,经纯化后可以在体外稳定的传4代以上,纯度为94.78%,形态类似成纤维细胞,GFAP染色呈阳性,细胞倍增时间约为2-3天。细胞与颗粒共培养,并经980nm近红外光照射后,MTT显示细胞存活率明显下降。电镜观察显示颗粒被细胞摄取,细胞膜皱缩,细胞核发生碎裂、溶解现象,线粒体溶解,核浆比例失调。细胞呈现凋亡或者坏死表现。将4种移植物分别移植到大鼠脊髓损伤区周围后4周开始,UCNPs-PEG-M540移植组动物的BBB评分显著高于其余3组(p<0.05)。BDA顺行示踪标记显示UCNPs-PEG-M540移植组较其余三组有较多的再生神经纤维通过损伤区。在横断面上,UCNPs-PEG-M540移植组阳性反应区域的IOD值显著高于其余三组(p<0.05)。NF200染色结果表明,UCNPs-PEG-M540移植组阳性反应面积的IOD值显著高于其余三组(p<0.05)。而GFAP染色结果表明,UCNPs-PEG-M540移植组阳性反应面积的IOD值显著低于其余三组(p<0.05)。(?)VesternBlot结果显示,GFAP的灰度值在UCNP-PEG-M540移植组的脊髓损伤区周围最少(F值=2.17,P<0.01),说明胶质瘢痕的形成在UCNP-PEG-M540移植组最少。[结论]在980nm近红外光的激发下,上转换纳米颗粒UCNPs-PEG-M540可以有效的杀伤与其共培养的星形胶质细胞,可以有效的减少大鼠脊髓损伤后胶质瘢痕的形成,并且促进轴突的再生和大鼠行为功能的恢复。
【作者】班德翔；
【导师】冯世庆；
【作者基本信息】天津医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】脊髓损伤(SCI)；上转换纳米颗粒(UCNP)；近红外线(NIR)；星形胶质细胞(Astrocyte)；光动力疗法(PDT)；胶质瘢痕(glialscar)；

【参考文献】
[1]吕佩卓,赖晓铮,赖声礼.基于小波多分辨率分析的PDF417定位算法[J].自动化学报,2008,05:597-600.
[2]赵静.中国知识分子与早期马克思主义传播研究[D].华侨大学,马克思主义基本原理,2014,硕士.
[3]倪文佳.沈阳高坎大桥施工控制[D].哈尔滨工业大学,交通运输工程,2013,硕士.
[4]朱晞.我国集合资金信托制度的检讨和展望——以投资者权益保护为中心[D].华东政法学院,法律,2004,硕士.
[5]陈晔林.江西联通3G业务发展策略研究[D].南昌大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[6]黄党志.基于Ising模型的QR码加密算法的设计与实现[D].重庆大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[7]吴姝欣.童年中后期的性别隔离现象及其与孤独感的关系研究[D].华中师范大学,发展与教育心理学,2014,硕士.
[8]蔡建民.房地产投资项目风险管理方法研究[D].北京交通大学,2008.
[9]汪玥.徽州文化与地域环境艺术研究[D].武汉理工大学,设计艺术学,2003,硕士.
[10]郭颖.轻资产盈利模式评价[D].内蒙古大学,会计,2014,硕士.
[11]彭伟,关集俱,黄亦申,李伟,许雪峰.填充β-环糊精/油酸包合物的酚醛树脂磨具的自润滑性能研究[J].中国机械工程,2014,13:1766-1772.
[12]张磊.钢管径向摩擦焊温度场数值模拟[D].机械科学研究总院,材料加工工程,2013,硕士.
[13]耿实.PLC的TIME－OUT故障原因及处理方法[J].冶金自动化,1995,01:56-58.
[14]卢晋,王梦依,邓春晖.简便合成TiO_2/石墨烯复合物用于磷酸化肽段选择性富集[A].中国化学会.中国化学会第28届学术年会第4分会场摘要集[C].中国化学会:,2012:1.
[15]王乔.安徽省池州市未成年人犯罪及其预防对策的调查[D].安徽大学,法律,2012,硕士.
[16]晏建军.地方投融资平台风险及化解对策分析[D].华中科技大学,企业管理,2012,硕士.
[17]孙晓磊.一种结合时间信息的动态事件追踪模型[D].河北大学,计算机系统结构,2014,硕士.
[18]聂晓波,詹庆才,段刚,于文娟,谢晓冬.跨调度中心WAMS动态数据的新型互联互通方案及关键技术[J].电网技术,2014,10:2839-2844.
[19]关勇.精密灌注机计量阀的研制及可靠性分析[D].西安理工大学,机械电子工程,2004,硕士.
[20]赵建辉,周易.工业用计算机安装环境标准(四)[J].冶金自动化,1985,04:51-53.
[21]陈红书.SAC包装有限公司存货管理改进方案[D].广东财经大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[22]张士丞.离子液体改性碳纳米管及其复合材料的制备[D].北京化工大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[23]刘伟.通用雷达装备维修编制决策支持系统研究[D].国防科学技术大学,2004.
[24]董炜1,陈卫征1,2,徐晓滨3,吉吟东1.基于可分性测度的模糊隶属函数确定方法[J].控制与决策.
[25]李倩.安丘市景芝镇污水处理方案设计与应用研究[D].山东大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[26]吴垠.银行WLAN Portal的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2014,硕士.
[27]邵冠兰.无线网络节点定位算法研究与系统实现[D].燕山大学,测试计量技术及仪器,2014,硕士.
[28]胡英.基于信息隐藏技术的安全收发电子邮件系统的研究与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[29]邹伦承.我国地方政府保障性住房有效供给研究[D].华中师范大学,行政管理,2012,硕士.
[30]黄师懿顺.论高中语文阅读教学中的整体感知与文本细读[D].华中师范大学,课程与教学论,2014,硕士.
[31]吴潇俊.船舶融资在上海国际航运中心建设中的创新研究[D].上海交通大学,工商管理,2013,硕士.
[32]刘明义.点动式燃烧控制[J].冶金自动化,1996,02:48-49.
[33]王飞.湖南湘绣专业人才培养模式改革研究[D].湖南师范大学,职业技术教育学,2013,硕士.
[34]张勇.高校学生干部人格魅力研究[D].内蒙古师范大学,思想政治教育,2013,硕士.
[35]李家栋,王昭东,李勇,付天亮,王国栋,路江海.连续固溶热处理线自动控制系统的开发及应用[J].冶金自动化,2010,04:32-36.
[36]卢召艳.环首都小城镇发展潜力与发展模式研究[D].中国地质大学（北京）,地理学,2013,硕士.
[37]张广韬.利用储能装置平抑风电预测误差的可行性研究[D].北京交通大学,电气工程（专业学位）,2013,硕士.
[38]郑思颖.艾森豪威尔政府的“对外信息和教育文化交流项目”研究[D].广西师范大学,世界史,2013,硕士.
[39]陈敏.~(99)Tc~m-VEGF_(125-136)-MAG_3多肽片段的制备及其在骨肉瘤荷瘤裸鼠体内分布与显像研究[D].河北医科大学,影像医学与核医学,2013,硕士.
[40]徐明.地佐辛与芬太尼应用于术后静脉镇痛的效果比较[D].大连医科大学,麻醉学,2012,硕士.
[41]黄志斌.国家数字地震台网中心技术系统集成中关键问题的研究[D].中国地震局地球物理研究所,2003.
[42]时立锋.空间站高性能组网技术研究及方案设计[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2010,硕士.
[43]梁存柱,朱宗元,王炜,裴浩,张韬,王永利.贺兰山植物群落类型多样性及其空间分异[J].植物生态学报,2004,03:361-368.
[44]孙爱哲.《后宫甄嬛传》网络热门小说改编影视剧分析[D].西南交通大学,艺术学,2013,硕士.
[45]王博.主机与双层底的有限元建模及液固耦合振动分析[D].大连海事大学,轮机工程,2013,硕士.
[46]马一禾.《韩非子》“说林”、“储说”研究[D].郑州大学,中国古代文学,2013,硕士.
[47]安灿彬,孙延明,赖朝安.基于知识的灯饰辅助工业设计系统[J].机电产品开发与创新,2005,05:30-32.
[48]刘文娟.三部件贮备系统的可靠性分析[D].燕山大学,概率论与数理统计,2013,硕士.
[49]廖仲国.甘肃省属上市公司独立董事履职情况调查报告[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[50]林序.白介素17对慢性心衰大鼠心肌JAK2水平的影响[D].泰山医学院,内科学,2012,硕士.