酸敏感离子通道1a在大脑皮质发育不良病理发生中的作用研究

【摘要】大脑皮质发育障碍(malformationofcorticaldevelopment,MCD)被看作是儿童药物难治性癫痫的重为重要的病因之一，其最鲜明的病理特征为大脑皮质板层结构的紊乱及异构神经元的出现。流行病学资料表明，约40%的儿童药物难治性癫痫是由MCD所致的，同时约75%的MCD患者会发生癫痫。MCD是一组病理学表现类似疾病的总称，主要包括局灶性皮质发育不良(focalcorticaldysplasia,FCD)、结节性硬化(tuberoussclerosiscomplex,TSC)、半侧巨脑症、多小脑回及Sturge-Weber综合征等亚型。而其中又以FCD和TSC最为多见。流行病学数据资料显示，FCD已成为我国药物难治性癫痫外科手术治疗的首要病因。2011年，国际抗癫痫联盟（Internationalleagueagainstepilepsy,ILAE）公布了最新版FCD分型标准。将其区分为孤立型FCD病灶和联合型FCD病灶。其中，孤立性FCD又可通过组织病理表现分为FCDI型和FCDII型。FCDI型的主要病理表现包括皮质板层结构的紊乱及肥大神经元（HNs）的出现。FCDII型除包含上述病理结果外，进一步出现异形神经元(DNs)和气球样细胞(BCs)，这些异常的细胞被统称为异构神经元(MCs)。先前已有大量研究关注了异构神经元的来源及其功能。目前公认的研究理论认为，异构神经元可能是异常的神经迁移、增殖和/或凋亡导致的。电生理研究表明，异形神经元具有高兴奋性，可能在癫痫发作中发挥重要作用。有趣的是，既往被认为发挥核心作用的气球样细胞，并不能产生动作电位。总之，目前对于异构神经元病理发生及FCD癫痫发生过程所知有限，具体机制仍有待阐明。酸敏感离子通道是一类可被胞外H+激活的非选择性阳离子离子通道，属于上皮钠通道ENaC/退化因子基因DEG通道家族成员，主要通透Na+、Ca2+。目前为止共发现6种ASIC蛋白亚型，分别由4种ASIC基因编码而成。ASIC1a是由ACCN2基因编码的，其在中枢神经系统和周围神经系统均有广泛的表达。先前已有大量文献证实，ASIC1a参与突触可塑性，学习记忆及恐惧情绪等生理过程。另一方面，ASIC1a在脑缺血，多发性硬化及癫痫等病理过程中，同样发挥重要的作用。有研究发现，在颞叶癫痫大鼠模型海马CA1-2区，ASIC1amRNA水平显著下调。更为重要的是，在体和离体研究均证实，ASIC1a可缩短癫痫发作时间，抑制癫痫发作进程。然而另一方面的证据显示，使用非特异性ASICs阻断剂Amiloride，可延缓边缘系统癫痫发作及癫痫持续状态的发生。在本课题的预实验中，我们发现手术切除的FCD临床标本中ASIC1a表达下降。那么，ASIC1a在FCD中的具体表达模式如何？下调表达的ASIC1a是否参与FCD病理发生和癫痫发生过程呢？这些问题都值得我们进一步关注。为了阐明ASIC1a在FCD病理发生中的作用。首先，使用real-timePCR、免疫印迹及免疫组织化学等技术观察了ASIC1a在临床FCD标本中的表达和分布；其次，为了了解ASIC1a参与的MCD癫痫发生过程，我们建立了一种“双打击”MCD大鼠模型，利用皮层脑电图技术，研究了ASIC1a拮抗剂Amiloride对癫痫潜伏期、持续时间及发作次数的调节效应；再次，通过原代培养大脑皮层神经元，我们证实了ASIC1a介导的酸诱导皮层神经元凋亡过程；最后，由于炎性因子可调节ASIC1a的表达和功能，我们检测了炎性细胞因子IL-2系统在FCD中的表达。通过上述研究，我们得到以下结果：一、ASIC1a在CTX和FCD中的表达分布1．Real-timePCR和Westernblot结果显示，正常大脑皮层中存在ASIC1amRNA和蛋白的表达，主要分布于锥体神经元和胶质样细胞上；2．在FCD皮质匀浆中，ASIC1amRNA及蛋白水平较正常对照组明显减弱，FCDII型组织中ASIC1a的表达显著低于FCDI型。免疫组化结果显示，FCD皮质中，ASIC1a的免疫反应性显著降低，主要表达于反应性星形胶质细胞和小部分异构神经元，包括：HNs、DNs及BCs。免疫荧光双标结果表明:①ASIC1a免疫阳性神经元和反应性星形胶质细胞共表达神经元标记物NeuN以及星形胶质细胞特异性标志物GFAP;②ASIC1a免疫阳性的MCs共表达NeuN，然而未见其共表达GFAP。3．Westernblot结果显示，FCD皮质组织匀浆中，抑制性中间神经元标志物parvalbumin(PV),calbindin(CB)和calretinin(CR)蛋白表达水平较正常对照组明显减低。二、ASIC1a对MCD大鼠癫痫发作的调节效应1．我们使用了孕17天大鼠宫内γ-射线照射，成年后给予腹腔注射戊四氮的方法建立的“双打击”MCD大鼠模型。免疫组织化学法检测发现，在γ射线照射组、PTZ组及γ-射线+PTZ组，ASIC1a的蛋白表达水平较正常对照组显著减低。再者，γ射线+PTZ组ASIC1a的表达水平显著低于γ射线照射组和PTZ组。此外，PTZ组ASIC1a表达水平显著低于γ射线组。2．PTZ注射前90分钟，腹腔注射ASIC通道的非特异性阻滞剂Amiloride。脑电图结果显示:①在正常大鼠组中，amiloride并未改变癫痫发作潜伏期、持续时间及发作次数等行为学指标；②而在MCD大鼠组，使用amiloride可延长癫痫发作潜伏期，而发作持续时间显著缩短。三、ASIC1a介导的酸诱导的皮层神经元凋亡1．原代培养小鼠大脑皮层神经元，分别给予不同PH值（PH6.8、PH7.0、PH7.1及PH7.2）的酸性培养基15、30及60分钟。乳酸脱氢酶检测结果显示，酸性培养基诱导皮层神经元LDH的释放具有明显的PH依赖及时间依赖性。而使用ASIC拮抗剂Amiloride及PcTX-1，可显著降低酸诱导的皮层神经元损伤。2．使用PH6.8的酸性培养基刺激培养的皮层神经元15分钟，可显著增加TUNEL阳性的细胞率。而使用Amiloride和PcTX-1可分别减少40%及30%的酸诱导凋亡比率。3．Westernblot结果显示，酸性培养基刺激培养的皮层神经元后，细胞活化凋亡蛋白Caspase-3表达增高。而Amiloride和PcTX-1可下调酸诱导的Caspase-3的表达。四、FCD病灶内IL-2系统的表达活化及细胞定位1．在FCD皮质组织匀浆中，IL-2及其受体IL-2Rs(IL-2Rα,IL-2Rβ,IL-2Rγ)的mRNA及蛋白表达水平较正常对照组明显增高。进一步研究发现，在FCDII型组织中，IL-2及其受体的表达显著高于FCDI型组织。原位杂交及免疫组化结果显示，IL-2及其受体在FCDI型组织中，强表达于HNs及细胞微柱；而在FCDII型组织中，强表达于异构神经元。免疫荧光双标结果显示：①IL-2及其受体免疫阳性神经元和反应性星形胶质细胞分别与神经元标记物NeuN以及星形胶质细胞特异性标志物GFAP共表达；②FCD病灶中的T细胞表达IL-2及其受体，然而小胶质细胞并未显示出IL-2及IL-2Rs免疫反应性；3IL-2及其受体阳性的MCs与NeuN共表达，然而未见其于GFAP共表达；4IL-2及其受体阳性的MCs与vimentin共表达。2．Westernblot结果显示，FCD病灶内IL-2下游信号通路分子JAK1、JAK3及p-STAT5蛋白水平较正常对照组织显著升高。再者，酶联免疫吸附实验结果显示，可溶性IL-2受体在FCD病灶内表达降低。上述结果提示，JAK-STAT及可溶性IL-2受体参与MCD的病理发生过程。综上所述，本研究结果表明：第一、临床FCD标本中ASIC1a表达显示下调，主要表达于反应性星形胶质细胞及异构神经元；第二、在MCD大鼠模型皮层中ASIC1a表达减低，使用ASIC1a拮抗剂可延长MCD大鼠的癫痫发作潜伏期，同时缩短发作持续时间；第三、使用ASIC1a拮抗剂可显著降低酸诱导的LDH含量、TUNEL阳性的神经元数量及凋亡蛋白caspase-3的表达，提示ASIC1a介导了酸诱导的皮层神经元凋亡；第四、炎性因子IL-2及其受体IL-2Rs(IL-2Rα,IL-2Rβ,IL-2Rγ)在FCD病灶中表达上调，而其下游信号通路JAK-STAT相关信号分子激活，提示IL-2可能通过JAK-STAT通路参与FCD的病理发生过程。总之，上述结果有力提示ASIC1a参与MCD的病理发生机癫痫发生过程。
【作者】郭为；
【导师】杨辉；
【作者基本信息】第三军医大学，外科学，2014，博士
【关键词】ASIC1a；大脑皮质发育障碍；局灶性皮质发育不良；异构神经元；结节性硬化；癫痫；脑电图；白细胞介素-2；

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