激活温度敏感性瞬时受体电位通道调控血管功能和血压的机制研究

【摘要】背景和目的：瞬时受体电位(transientreceptorpotentials,TRPs)通道是细胞质膜上的非选择性阳离子通道,其部分亚型因对温度敏感被称为温度敏感性TRP通道(thermo-TRPs)。温度敏感性TRP通道共有10个成员,分别是TRPA1、C5、M2、M4、M5、M8、V2、V3和V4,因激活温度不同分为伤害热感受器、温和温度激活TRP和冷感受器。TRPV1和TRPV2是伤害热感受器,冷感受器包括TRPA1和TRPM8,其他的为温和温度激活TRP。温度敏感性TRP通道分布于初级感觉神经元,感受环境温度变化,并将温度信息以电生理信号形式传递至神经中枢,兴奋交感神经,引起外周血管的收缩或舒张,增加产热或促进散热。这些通道表达和功能异常,会导致机体温度感觉超敏或失敏。温度敏感性TRP不仅分布于神经组织被温度变化所激活,还广泛地分布于血管组织,被渗透压变化、牵张力改变、天然或合成的化合物以及内源性配体激活物,参与调节血管的生理功能。血管功能异常,包括血管张力调节、内皮依赖性血管舒张功能异常、内皮高通透性、平滑肌细胞增殖和迁移,以及对炎症介质、氧化应激、血管活性物质的高反应性,促进高血压、冠状动脉硬化心脏病、卒中等心脑血管发生和发展。目前心脑血管疾病仍是威胁人类健康的首要疾病,改善血管功能是疾病早期有效控制疾病进展的必然途经。由于钙离子代谢对调节血管内皮细胞(ECs)和血管平滑肌细胞(VSMCs)功能具有重要作用,而大多数温度敏感性TRP通道都对钙离子具有通透性,这为我们预防和治疗血管相关疾病展开了新的视野。TRPM8在血管组织主要表达于VSMCs,薄荷醇激活TRPM8可以引起钙离子内流,但发现薄荷醇激活大鼠尾动脉TRPM8却抑制缩血管物质诱导的动脉血管收缩,表现为短暂的血管收缩后出现持续的舒张,但其机制目前仍无统一定论。有研究认为是抑制了电压门控通道诱导的钙内流所致,但肌细胞的持续收缩有赖于钙库操控钙通道和持续的小量钙内流以保证胞内游离钙离子水平,同时需要Rho激酶通路参与的肌细胞钙敏化作用参与。低温激活TRPM8诱导胃底平滑肌收缩,其中便有Rho激酶通路参与调节平滑肌收缩作用,说明TRPM8与Rho激酶通路之间存在一定联系。但薄荷醇却并未如同低温引起平滑肌收缩,临床上常用薄荷成份来缓解肠道平滑肌痉挛。研究发现人前臂局部涂擦TRPM8激动剂薄荷醇引起血管扩张,尽管血压变化无显著差异,但平均动脉压表现为下降趋势。基于此,我们假设薄荷醇激活TRPM8后干扰RhoA/ROCK通路的钙敏化作用,并影响钙库操控钙通道功能,抑制血管收缩,并具有降低血压作用。另一种研究广泛的温度敏感性TRP亚型TRPV1,在血管组织主要表达于ECs、VSMCs和管周感觉神经,已经明确其通过多种途经参与调节血管舒缩功能,长期激活TRPV1对自发性高血压大鼠(SHR)具有降压作用。但在合并其他危险因素条件下,特别是糖尿病合并血管病变时,其是否仍有保护作用尚不清楚。糖尿病是心血管疾病的独立危险因素,高血糖主要通过增加血管内皮细胞氧化应激状态对血管内皮功能造成损伤,增加的活性氧簇(ROS)降低内皮型一氧化氮合酶(eNOS)生物活性,减少NO生成。线粒体是ROS的主要来源之一,表达于线粒体的解偶联蛋白2(UCP2)是ROS生成的生理条件因子,其主要受环磷酸腺苷/蛋白激酶A(PKA)调节。前期研究发现激活TRPV1,可以激活Ca2+敏感的PKA调节eNOS活性,辣椒素也可以增加肝脏和脂肪组织UCP2表达。因此,我们提出糖尿病病理状态下,长期激活TRPV1可以通过PKA途经上调线粒体UCP2表达,减少ROS产生,增加eNOS活性,促进NO生成,并缓解高糖所致血管功能紊乱。本研究分为两部分进行。第一部分探讨激活冷感受器TRPM8通道对于血管功能的影响及其机制。分题一,TRPM8在血管平滑肌细胞的表达情况；分题二,长期薄荷醇饲食激活TRPM8对动物血管舒张功能和血压的影响；分题三,激活TRPM8对平滑肌细胞RhoA/ROCK通路蛋白表达影响,对肌细胞收缩时相影响,不同调节肌细胞膜钙通道制剂对细胞内钙离子水平的影响；分题四,观察口服薄荷醇对高血压前期受试者血管功能和血压的影响。第二部分探讨激活热感受器TRPV1通道对糖尿病病理状态下血管功能的影响及其机制,检测长期辣椒素饲食激活TPRV1对糖尿病小鼠血管和血压的影响,对内皮细胞NO生成相关蛋白水平的影响,以及血管内膜ROS和NO的生成影响。材料和方法：整个研究由离体实验、在体实验和临床试验三部分组成。离体实验以培养动物的胸主动脉内皮细胞以及肠系膜动脉为研究对象。在体试验采用了多种动物模型：包括C57/BL6J野生型(WT)和TRPM8基因敲除TRPM8小鼠、SHR模型,分为薄荷醇组(含0.5%薄荷醇饲料)和对照组(普通饲料),饮食干预28周；C57BL/KsJ野生型小鼠和糖尿病小鼠(db/db)模型,分为辣椒素组(含0.01%辣椒素饲料)和对照组(普通饲料),饮食干预14周。临床试验以高血压前期受试者为研究对象,随机分配至薄荷醇组和安慰剂组,进行为期8周的随机、双盲、安慰剂对照干预试验。1.采用RT-PCR,蛋白免疫印迹、免疫荧光染色等分子生物学技术,检测TRPM8在小鼠主动脉组织和肠系膜动脉平滑肌细胞表达情况。2.采用小血管张力测定技术检测薄荷醇急性刺激后小鼠肠系膜动脉舒缩功能,以及薄荷醇或辣椒素长期膳食干预的WT小鼠、TRPM8-/-小鼠、SHR、db/db小鼠等动物模型的肠系膜动脉或主动脉血管舒缩功能情况。3.采用无线遥测信号系统检测薄荷醇干预后清醒状态下WT小鼠、TRPM8-/-小鼠、SHR动态血压情况；采用鼠尾测压方法检测清醒状态下SHR薄荷醇干预后鼠尾血压,以及小db/db鼠辣椒素干预后鼠尾血压情况。4.采用蛋白免疫印迹技术检测薄荷醇急性刺激或长期干预后小鼠和SHR肠系膜动脉RhoA/ROCK信号通路蛋白表达情况；C57BL/KsJ野生型小鼠和db/db小鼠辣长期椒素干预后主动脉和肠系膜动脉TRPV1和NO产生相关信号通路蛋白(phospho-PKA、UCP2、p22phox、eNOS)。5.采用比率荧光成像系统检测薄荷醇刺激后血管平滑肌细胞内游离钙离子([ca2+]i)情况。6.采用荧光显像技术检测长期辣椒素干预后db/db小鼠肠系膜动脉内膜面的超氧阴离子水平和NO水平。7.采用水银柱血压检测方法测量临床高血压前期受试者薄荷醇干预期间诊室血压；采用动态血压检测技术检查薄荷醇干预前后动态血压。8.采用血管超声技术检测薄荷醇干预前后临床高血压前期受试者血管舒张功能,包括血流介导的血管舒张和硝酸甘油诱导的血管功能。结果：1.TRPM8在小鼠主动脉和肠系膜动脉血管平滑肌细胞均有表达。2.长期薄荷醇膳食干预激活TRPM8后,降低野生型小鼠和SHR肠系膜动脉对缩血管物质血栓烷A2类似物U46619的反应,并降低野生型小鼠和SHR的动态血压、鼠尾血压,而对TRPM8-/-小鼠均无效。3.急性激活TRPM8或应用ROCK抑制剂Y27632均抑制U46619刺激下的肠系膜动脉VSMCsRhoA/ROCK通路蛋白表达增加,薄荷醇长期激活TRPM8均减弱野生型小鼠和SHR肠系膜动脉VSMCsRhoA/ROCK通路蛋白表达,但对TRPM8-/-小鼠无效。4.薄荷醇急性激活TRPM8的呈浓度依赖性抑制U46619诱导的血管收缩,以抑制肌细胞收缩持续相为主,内皮剥脱影响不明显,可以被TRPM8基因敲除或TRPM8抑制剂阻断,但TRPM8基因敲除对Y27632的抑制血管收缩作用无影响；薄荷醇抑制U46619诱导的钙库操控性钙通道,TRPM8基因敲除抑制作用消失。5.长期薄荷醇胶囊口服治疗改善高血压前期受试者内皮依赖性和非依赖性血管舒张功能,并降低血压。6.长期辣椒素膳食干预增加糖尿病小鼠肠系膜动脉TRPV1表达、PKA磷酸化水平、UPC2表达,降低p22phox水平和血管内膜ROS生成水平,增加;NOS磷酸化和NO生成。7.长期辣椒素膳食干预改善糖尿病小鼠肠系膜动脉血管舒缩功能,但对血压影响无显著差异。结论：1.薄荷醇激活TRPM8抑制缩血管物质引起的钙库钙释放,抑制RhoA/ROCK通路调节的血管平滑肌细胞钙敏化作用,减弱肌细胞瞬时相和持续相收缩,改善阻力血管张力,长期激活TRPM8降低自发性高血压大鼠血压。2.长期口服薄荷醇胶囊有助于高血压受试者血管功能改善和血压降低。3.辣椒素激活TRPV1促进PICA_磷酸化,上调UCP2表达,抑NAD(P)H氧化酶活性和ROS生成,增加eNOS生物学活性,促进NO合成和释放,长期辣椒素膳食干预改善糖尿病小鼠血管舒张内皮依赖性舒张功能,是对抗高糖致血管内皮损伤的有效途经。
【作者】孙靖；
【导师】祝之明；
【作者基本信息】第三军医大学，内科学（专业学位），2014，博士
【关键词】瞬时受体电位melastatin8；瞬时受体电位香草醛亚型1；血管功能；薄荷醇；辣椒素；Rho激酶；解偶联蛋白2；

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